Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, elektrokimyasal sensörler kullanarak bakterileri tespit etmek ve tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle bakterilerden ribozomal RNA'nın salınmasıyla sağlanarak florlanmış dedektör probu ile hibridizasyona izin verilir; ikinci adımda, dedektör probuna bağlı ribozomal RNA çalışma elektroduna eklenir ve böylece sensör yüzeyindeki yakalama probu ile hibridizasyon gerçekleşir. Ardından, anti-florescein yaban turbu peroksidaz konjugatının florlanmış dedektör probuna bağlanmasına izin verilir.

Son olarak, yoğunluğu sensör yüzeyindeki yakalama probu ribozomal RNA detektör probu komplekslerinin sayısı ile ilişkili olan interferometrik akım elde edilebilir. Bu tekniğin kültür tabanlı yöntemlere göre temel avantajı, bakterilerin yaklaşık 45 dakika içinde tespit edilip tanımlanabilmesi ve böylece EDGAR plaklarında görünür bir koloni oluşması için gereken gece boyu bekleme süresinin ortadan kaldırılmasıdır. Bu tekniğin uygulanması, bulaşıcı hastalıkların yönetimini geliştirecektir.

Bakteriyel patojenlerin erken teşhisi, hedefe yönelik antibiyotik tedavisi ve iyileştirilmiş klinik sonuçlar için temel öneme sahiptir. Bu yöntem, bulaşıcı hastalıkların teşhisi için yararlı olduğu gibi, immünodiagnoz gibi diğer tanısal sorunlara da uygulanabilir. Yakalama probundaki tiyol grubunun indirgenmiş olduğundan emin olmak ve böylece daha tutarlı sonuçlar elde etmek için, seyreltilmiş yakalama probunu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca heksan ditiyol ile inkübe ederek işleme başlayın.

İnkübasyondan sonra, herhangi bir nemi veya partikülü gidermek için altın kaplama 16 sensör dizi çiplerine beş saniye boyunca azot akışı uygulayın. Sensör dizisindeki çalışma elektroduna küçük hacimlerde sıvı dikkatle uygulanmalıdır. Bu tekniğin görsel gösterimi kritik önem taşımaktadır.

Pipetleme, yıkama ve kurutma tekniklerinin doğru şekilde uygulanması, çipden çipe değişkenliği önemli ölçüde azaltır. Ardından, HDT seyreltilmiş yakalama probu karışımından altı mikrolitre'yi sensör dizisindeki 16 sensörün tamamının çalışma elektroduna uygulayın ve sensör çiplerini kapalı bir Petri kabında dört derece Celsius'ta gece boyunca saklayın. Ertesi gün, sensör çiplerini iki ila üç saniye boyunca deiyonize su ile yıkayın ve ardından çipleri beş saniye boyunca bir nitrojen akımı altında kurutın. Şimdi, attri hidroklorür sodyum klorür, EDTA MERKAPTOETANOL solüsyonundan altı mikrolitre'yi 16 sensörün tamamının çalışma elektroduna uygulayın ve sensörleri oda sıcaklığında bir Petri kabında 50 dakika boyunca inkübe edin.

Elektrokimyasal sensör analizi için örnekleri hazırlamak üzere, logaritmik büyüme evresindeki bakteriyel kültürden 1 mL'yi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve ardından hücreleri 16,000 gx hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Patojenik bakterilerin biyogüvenlik kabininde işlenmesi gerektiğini lütfen unutmayın.

Snat'ı çıkardıktan sonra, 10 µL 1 M sodyum hidroksit içeren bir pipet ucunu mikro santrifüj tüpünün altına uygulayın ve peleti tamamen yeniden süspand etmek için birkaç kez yukarı aşağı pipetleyin. Süspansiyonu oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra, bakteriyel lizatı nötralize etmek için sığır serum albümini veya BSA ve floresein modifiyeli bir detektör probu içeren 50 µL PBS ekleyin. Ardından, nötralize edilen lizatı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Bu adıma, hazırlanan sensör çiplerinden birindeki merkaptoetanol çözeltisini iki ila üç saniye boyunca deiyonize su ile yıkayarak başlayın. Çipi az önce gösterildiği gibi kuruttuktan sonra, nötralize edilmiş bakteri lizatından dört µL'yi çalışma elektrotlarına uygulayın. Sensörlerin 14'ü.

Ardından, PBS artı BSA artı floresein modifiyeli detektör probu içeren dört mikrolitre köprüleme oligonükleotidini iki pozitif kontrol sensörüne uygulayın. Lizatı ve pozitif kontrol sensörlerini 15 dakika inkübe ettikten sonra, tüm sensör çipini daha önce olduğu gibi yıkayın ve ardından kurutun. Şimdi, kazein içeren PBS içindeki dört mikrolitre anti-floresein yaban turpu peroksidazını veya HRP'yi 16 sensörün tamamının çalışma elektrotlarına uygulayın.

15 dakikalık inkübasyonun ardından, sensör çipini yıkayın ve kurulayın. Ardından, sensör çipinin yüzeyine bir film kuyu etiketi yapıştırın ve çipi sensör çipi yuvasına yerleştirin; 16 sensörün her birinin üzerine 50 µL TMB substratı pipetleyin ve sensör çipi yuvasını kapatın. Son olarak, 16 sensörün tamamı için pirometri ve döngüsel telemetri ölçümlerini elde etmek amacıyla bir Helios çip okuyucu kullanın.

Az önce açıklanan elektrokimyasal analiz, bu şekilde gösterildiği üzere bir sandviç ELISA'ya benzer şekilde yapılandırılmıştır; hedef ribozomal RNA'nın yakalama ve dedektör problarıyla hibridizasyonu, dedektör probundaki üçlü floresein bağına bağlanan anti-floresein antikor fragmanlarına konjuge HRP tarafından katalize edilen bir redoks reaksiyonu ile saptanır. Analiz hassasiyetinin önemli bir bileşeni, altın elektrodun yüzey kimyasıdır. Altın elektrod, merkaptoetanol ve hint yağı ile kaplanmış olup seyreltilmiş yakalama problarının eklenmesiyle fonksiyonelleştirilmiştir.

Hedef ribozomal RNA'nın yakalama probu ve floresein işaretli detektör probu ile sandviç hibridizasyonu, anti-floresein yaban turbu peroksidaz konjugatı ve TMB substratının eklenmesiyle saptanan bir kompleksle sonuçlanır. M parametrik akımı, TMB'nin yaban turbu peroksidaz tarafından oksidasyonu ve TMB'nin elektrottan gelen elektronlarla redüksiyonundan kaynaklanan redoks döngüsü tarafından oluşturulur. Burada gösterilen analizlerde gene fluidic 16 sensör dizi çipi kullanılmıştır.

Dizideki sensörlerin her biri, çipin kenarında temas noktaları bulunan çalışma, referans ve yardımcı olmak üzere üç elektrot içerir. Çip okuyucu, her bir temas noktasına bağlanan pogo pinlere sahiptir. Çip okuyucu, sensör dizisi ile bilgisayar algoritması tarafından kontrol edilen bir potansiyometre için bir arayüz görevi görür.

Burada, bir elektrokimyasal sensör akım akışına örnekler gösterilmiştir. Parametrik ölçümler başladıktan sonraki ilk birkaç saniye boyunca sensörlerdeki akım akışı yapay olarak yüksektir. TMB'nin sensör yüzeyine uygulanmasından okuyucu algoritmanın başlatılmasına kadar geçen sürede okside substrat biriktiği için, akım akışı ardından hızla kararlı bir duruma ulaşır ve 60 saniye içinde güvenilir şekilde doğru sensör okumaları elde edilebilir.

Sensörden sensöre değişkenlik nispeten sabittir, bu nedenle gene fluidic 16 sensör dizisi çipi üzerinde paralel olarak 16 farklı sensör analizi gerçekleştirmek mümkündür; pozitif ve negatif kontroller esastır. Bu amaçla, hem yakalama hem de dedektör problarına hibridize olan ve bilinen konsantrasyonda sentetik bir hedef görevi gören sentetik bir köprüleme DNA oligonükleotidi kullanılır. Köprüleme oligonükleotidi kullanılarak elde edilen sonuçlar, çipten çipe değişkenliği minimize etmek için dahili bir kalibrasyon kontrolü görevi görür.

Elektrodun negatif akımı ne kadar büyükse, sinyal o kadar yüksek olur. Yakalama ve dedektör probları test edilirken, tespit sınırı, bilinen konsantrasyondaki bir numunenin seri dilüsyonu ile belirlenmelidir; bu şekildeki figürde gösterildiği gibi, analizin dinamik aralığı boyunca numune konsantrasyonu ile sinyal çıktısı arasında lineer bir log-log korelasyon vardır.

Bu sütun grafiklerinde, idrar yolu enfeksiyonu olan hastaların idrarında sıklıkla rastlanan esia coli, kleb seal ve amonyak içeren örnekler için temsili sonuçlar gösterilmiştir; sensörlerin çoğunda sinyaller düşük ve benzer olacaktır ve bu negatif sonuçlar arka plan sinyali olarak birleştirilebilir; KE prob çifti ile reaktivite, canon'u e coli'den ayırır. Köprüleme oligonükleotid pozitif kontrol ve dahili kalibrasyon standardı olarak hizmet eder. Bu teknik, bakterilerin antibiyotiklere karşı fenotipik yanıtı ölçülerek, klinik örneklerdeki antibiyotik dirençli bakterilerin tespitinde uygulanabilir.

Bu teknik, münferit bir hasta için optimum tedavinin belirlenmesinde kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, çipteki farklı türe özgü sensörlerdeki atrik akımlarını karşılaştırarak bakterilerin nasıl tespit edileceği ve tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.