Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, protein bağlama ortaklarını izole etmek için Tandem afinite saflaştırması olarak bilinen bir yöntemi kullanmaktır. Merhaba, ben Imperial College London Viroloji bölümünden dLAN Bailey. Laboratuvarımızda, virüs ailesinin farklı üyeleri için virüs-konak etkileşimleri üzerine çalışıyoruz.

Diğer hücresel veya viral proteinlerle etkileşime giren proteinlerin belirlenmesi, enfeksiyon sırasında virüs ve konakçısı arasındaki etkileşimi araştırmak için harika bir başlangıç noktasıdır. Bu videoda, laboratuvarımızda kullandığımız bir yaklaşım olan tandem afiniten ve e saflaştırma veya TAP etiketleme yöntemini açıklayacağım. Bu çalışmada kullanılan Tap etiketi, iki Protein G birimi ve bir streptavidin bağlayıcı peptitten oluşan N-terminal bir etikettir.

Bunlar, yem proteinin spesifik elüsyonuna olanak tanıyan bir TEV proteaz kesim dizisi ile birbirinden ayrılmıştır. Bu örnekte, fare EIF 4E, bu füzyon konstrüktünün C terminusünde yer almaktadır. Tap etiketleme protokolü altı adımlı bir prosedürdür.

Transfeksiyon ve hücre hatlarının oluşturulmasının ardından, hücreler hafif bir lizis tamponunda bekletilmeden önce etiketli abate proteinini eksprese etmeleri için indüklenir. Hücre hatlarını oluşturmak amacıyla, yem proteini ve olası etkileşen ortaklarını saflaştırmak için iki afinite saflaştırma adımı ve iki spesifik çözelti kullanılır. HEC 2 93 hücreleri, kodlayan P met dört ekspresyon vektörü ile transfekte edilmelidir.

Ardından, tap etiketli yem protein hücreleri 100 µg/ml higromisin B ile seçilir. Plazmit episomal olarak korunduğundan, spesifik klonları izole etmeye gerek yoktur. 10 konfluen hücre flaskı, medyuma kazınarak toplanmadan önce 16 saat boyunca 10 µM kadmiyum klorür uygulamasıyla indüklenir. Süspansiyon halindeki hücreler daha sonra 15 mL tüplere aktarılır ve santrifüj ile peletlenir.

Bu hücreler, nihayet çöktürülmeden önce üç kez buz gibi soğuk PBS ile yıkanır. İkinci adım hücre lizisinde hücreler, beş dakika boyunca buz üzerinde bekletilmeden önce tekrarlayan pipetleme ile beş ml soğuk lizis tamponu içerisinde lizize edilir. Etkin bir lizis sağlamak için hücreler daha sonra dar gauge'li, küt uçlu bir iğne ile şırıngalanır ve dondur-çöz döngüsüne tabi tutulur.

Elde edilen süspansiyon 1,5 ml'lik tüplere paylaştırılır ve santrifüjle çözünmemiş hücreler ile debrisler uzaklaştırılır. Bu santrifüj adımının ardından pelet boyutunun belirgin şekilde azaldığı dikkat çeker. Lizat süpernatanları daha sonra 15 ml'lik bir Falcon tüpünde birleştirilir ve ek debrislerin uzaklaştırılması için 0,45 mikrometrelik bir filtreden geçirilir.

Sonraki analizler için bu lizattan 50 µL'lik alikotlar alınmalıdır. Bu örnek, örnek bir olarak adlandırılır. Üçüncü adım, tavşan IgG Aeros'a bağlanma.

Protokolün bu aşamasında, protein G etiketleri tavşan IgG aros ile immünopresipite edilir. Aros boncuklarını paylaştırmak için pipet ucunun ucunu kesin. Bu işlem, boncukların zarar görmesini önlemeye yardımcı olur.

Tavşan IgG aro solüsyonunu, arosları 15 ml'lik bir tüpe aktarmadan önce şişeyi dairesel hareketlerle sallayarak nazikçe yeniden süspande edin. Her adımda boncukların berraklaşmasını sağlamak için düşük hızlı santrifüj kullanarak arosları soğutulmuş lizis tamponu ile üç kez yıkayın. Santrifüj sonrası çöken tavşan IgG boncukları görünür olmalıdır.

Her adımdan sonra, boncukları yerinden oynatmadan tampon çözeltiyi dikkatlice uzaklaştırın. Son yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, filtrelenmiş ve berraklaştırılmış lizatı paketlenmiş boncuklara ekleyin ve üç saat boyunca veya gece boyunca inkübe edin. Döndürücü bir karıştırıcı kullanarak 4 °C'de inkübasyon yapılması tercih edilir.

İmmünopresipitasyonun ardından, agroz boncukları santrifüjle çöktürün ve sonraki analizler için süpernatantı uzaklaştırın. Gerekirse, tüpte kalan sıvıyı tamamen temizlemek için ince uçlu bir pipet ucu kullanabilirsiniz. Bu süpernatant, örnek iki adım dört TEV proteaz kesimi için kullanılacaktır.

Bu adımda, yem protein protein G etiketlerinden ayrılır. Bu adım, yem proteinin spesifik olarak kesilmesini sağlayarak, tavşan IgG ile yapılan immünopresipitasyon işleminden etkili bir elüsyon adımına imkan tanır. TEV kesim karışımını hazırlayın ve ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak bunu boncuklara ekleyin; bu karışımı silikonize bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de gece boyu inkübasyondan önce boncukların süspansiyon haline gelmesi için tüpü ters çevirerek karıştırın, analiz için bu TEV kesim reaksiyonundan bir alikot alın.

Bu üçüncü örnektir. Döner karıştırıcıda gece boyu inkübasyon, TEV reaksiyonunun neredeyse tamamlanmasını sağlayacaktır. Beşinci adım, immobilize streptavidin boncuklarına bağlanma işlemidir.

Bu adımda, Cleve yemi ve olası tüm bağlanma ortakları çözeltiden afinite yöntemiyle saflaştırılır. İlk olarak, tavşan IgG aros boncuklarını içeren TEV kesim reaksiyonunu santrifüjleyin. Aros boncuklarını çöktürmek için, berraklaşmış süpernatantın bir kısmını analiz için alın.

Bu, dördüncü örnektir. Yem proteinini içeren geri kalan tüm süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Tekrar ince uç kullanın.

Tüm olası süpernatantı uzaklaştırmak için pipet uçlarını hazırlayın. Sonraki analizler için tavşan IgG aros boncuklarını saklayın. Bu, beşinci örnektir.

Strep-avidin boncuklarının zarar görmesini önlemek için, bir pipet ucunun ucunu kesin. Boncukları nazikçe resüspande edin ve bir aliquot'u silikonize bir tüpe aktarın. Strep-avidin boncuklarını S tamponu ile yıkayın ve düşük hızlı santrifüj ile berraklaştırın.

Her yıkamadan sonra. Her yıkamadan sonra, tamponu dikkatlice uzaklaştırın. Streptadin boncukları çok küçüktür ve ince uçlar kullanıldığında bile kolayca yerinden oynayabilir.

Boncukları hazırlayın. Strept adin boncukları yıkandıktan sonra, TEV kesim reaksiyonundan elde edilen süpernatantı bu boncuklara ekleyin ve reaksiyonu bir döner karıştırıcı kullanarak dört derece C'de üç saat veya gece boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından streptavin boncuklarını santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Bu, örnek altıdır. Not edilmelidir.

Beit proteini artık tüpte kalan boncuklara bağlanmış durumdadır. Yem proteinini içeren streptavidin boncuklarını lizis tamponu ile yıkayın. Herhangi bir ek kontamine proteinleri uzaklaştırmak için, boncukların üzerindeki kalan yıkama solüsyonunu alın ve boncukları buz üzerinde bekletin.

Altıncı adım, biyotin elüsyonu. Bu adımda, streptavidin boncuklarına biyotin eklenir. Biyotin ile streptavidin boncukları arasındaki etkileşim, çözeltiye geri dönen yemi yerinden çıkarır.

Biotin çözeltisini doğrudan boncukların üzerine ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Reaksiyonu bir döner karıştırıcı santrifüj kullanarak 4 °C'de üç saat veya gece boyunca inkübe edin, biotin aeros karışımını ve karışımı dikkatlice yeni bir tüpe toplayın. Bu, örnek yedi olarak adlandırılan nihai EIT'nizdir.

Kalan strept havein boncukları sekizinci örneği oluşturur. Düşük protein konsantrasyonu nedeniyle, bu son elüat analizden önce konsantre edilmelidir. Bu işlem, düşük moleküler ağırlık kesme noktalı spin kolonları kullanılarak, süreç düzenli olarak izlenirken santrifüj yoluyla hacmin azaltılmasıyla gerçekleştirilir.

Bu konsantre örnek bölünerek SDS-PAGE jellerinde Coomassie ve gümüş boyama ile analiz edilebilir. Örneklerin kütle spektrometrisi ile analiz edilmesi planlanıyorsa, hazır ticari jellerin kullanılması önerilir. Ardından münferit bantlar çıkarılabilir ve proteinler kütle spektrometrisi ile tanımlanabilir.

Bu vakada, yem olarak murin, E proteini için EIF kullanılmıştır. TAP sisteminin avantajı, ilgilendiğiniz proteini belirli bir hücre hattında eksprese edebilme imkanı sunmasıdır ve ilgilendiğiniz hücre hattına bağlı olarak, proteini nispeten düşük seviyelerde eksprese etme olanağı da sağlar. Buna siz karar verirsiniz ve tüm translasyon sonrası modifikasyonlar ile lokalizasyon korunduğundan, genellikle doğal kompleksi saflaştırabilirsiniz.