Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, model bir glikoproteindeki n ve O bağlantılı glikozilasyonun enzimatik deglikozilasyonu ve analizi için glikosat kullanımını göstermektir. Bu işlem, bir glikoproteinin PGA's F veya protein deglikozilasyon karışımı ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Ayrıca, protein deglikozilasyon karışımı, bazen aksi takdirde dirençli olan şekerlerin uzaklaştırılmasına yardımcı olan ek ekzo gliko ass karışımı ile takviye edilmiştir.

Bu yöntemi, model bir glikoprotein olan rekombinant insan koryonik gonadotropine beta (HCG beta) kullanarak örneklendiriyoruz; ardından SDS page, Kumasi blue boyama ve şeker spesifik bir boyama yöntemi uygulanmaktadır. D glikozilasyonunu analiz etmek için Pro Q Emerald 300 kullanılmıştır. Elde edilen HCG beta örnek sonuçları, glikozilat işlemiyle ve işlem olmadan protein migrasyonundaki farklara ve glikanlar kademeli olarak uzaklaştırıldıkça ProQ boyamasındaki sinyalin azalmasına dayanarak, HCG beta'nın heterojen olarak glikozilendiğini ve birden fazla glikoform içerdiğini göstermektedir.

Bu tekniğin kütle spektrometrisi analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı; basit olması, yaygın laboratuvar ekipmanlarını kullanması ve yeni başlayan glikobiyologlar için uygun olmasıdır. Bu yöntem, proteinimin glikozillenip glikozillenmediği gibi glikobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Enzimatik deglikozilasyona başlamak için protein deglikozilasyon kitinden çıkan tampon çözeltileri çözdürün.

Tüpleri iyice karıştırın ve oda sıcaklığında tutun. Enzim içeren flakonları buz üzerine yerleştirin, HCG beta flakonunun içeriğini 600 µL distile suda çözün ve buz üzerinde tutun. 10x stok çözeltiyi distile su ile seyrelterek 1 mL 1XG seven tamponu hazırladıktan sonra, 0,5 µL PGA's f'yi seyreltmek için 25 µL kullanın.

Dört ekzo glikozidazın her birinden iki mikrolitre birleştirerek ekzo glikozidaz karışımını hazırlayın. Ardından, yazılı protokolde belirtildiği üzere yedi numaralandırılmış PCR tüpüne HCG beta ve 10x glikoprotein denatürasyon tamponu ekleyin, tüplerin kapaklarını kapatın ve nazikçe karıştırın. Proteinleri, termosiklet cihazında 10 dakika boyunca 94 °C'de inkübe ederek ve ardından 4 °C'de bekletilerek denatüre edin. Tüpleri termosikletten çıkardıktan sonra, görünen tüm yoğunlaşmaları gidermek için santrifüjleyin; her bir reaksiyon tüpüne yazılı protokole uygun olarak kalan reaktifleri ekleyin. PCR tüplerini yeni kapaklar kullanarak kapatın.

Ardından, içerikleri santrifüjle çöktürdükten sonra tüpleri hafifçe dört kez vurarak karıştırın, tüpleri termosikler cihazına yerleştirin ve 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Bunu, örnekleri 4 °C'ye soğutarak takip edin. SDS-PAGE kurulumu için, taze 3x redükleyici SDS yükleme tamponu hazırlayın.

DTT içeren hazırlanan 3x indirgeyici SDS yükleme tamponundan her örneğe 12,5 µL ekleyin, tüpleri yeni kapaklarla kapatın ve karıştırmak için tüplere hafifçe vurun. Tüpleri bir termosiklet cihazında 94 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin ve ardından 4 °C'ye soğutun. İnkübasyonun ardından, her örnekten 30 µL ve protein marköründen 10 µL'yi %10 ila %20'lik triglisin jeline yükleyin. Her örneğin geri kalanını saklayın.

D cephesi jelin altına yaklaşana kadar jeli 130 volt ile elektroforez yapın. Jel çalışması tamamlandığında, jeli kalıptan çıkarın ve jeli kaplayacak kadar kumasi mavisi boya içeren küçük plastik bir kutuya yerleştirin. Jel boyandıktan sonra, hafif ajitasyon eşliğinde bir saat boyunca bekletin.

30 dakika boyunca üç kez yıkayın. 50 mililitre stain çözeltisi içerisinde, beyaz ışık transilüminatörü veya tarayıcı kullanarak görüntüleri kaydedin. Alternatif olarak, jel selofan tabakalar arasında kurutulabilir.

Gel çalışırken, bir çerçeve içinde her örnekten kalan kısmı ve bir protein markörünü %10 ila %20'lik Tri-glisin jelde yürütün. ProQ emerald reaktifini DMF ile çözün ve kit ile birlikte verilen ürün kılavuzunu takip ederek boyama için stok tespit, yıkama ve oksidasyon çözeltilerini hazırlayın. Elektroforez tamamlandığında, jeli kalıptan çıkarın ve plastik bir kutuya yerleştirin.

Hazırlanan fiksasyon solüsyonundan 100 mililitre ekleyerek jeli fikse edin. Jeli oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla gece boyunca bekletin. Jeli, hazırlanan yıkama solüsyonundan 100 mililitre ile oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla 10 ila 20 dakika boyunca yıkayın ve yıkama işlemini taze yıkama solüsyonu ile ikinci kez tekrarlayın.

Ardından, jeli hazırlanan oksidasyon çözeltisinin 25 mililitresi içinde hafif ajitasyonla 30 dakika inkübe ederek karbonhidratları okside edin; inkübasyonu, jel yıkanırken iki ek yıkama ile takip edin. Kit içerisinde sağlanan 25 mililitre boyama tamponuna 500 mikrolitre ProQ Emerald 300 reaktif çözeltisi ekleyerek taze ProQ emerald 300 boyası hazırlayın. Jeli, boyama işlemini takiben, hazırlanan boya içerisinde karanlık koşullarda ve hafif ajitasyonla 90 ila 120 dakika inkübe ederek boyayın.

Daha önce açıklandığı şekilde iki yıkama adımını tekrarlayın. Ardından, 300 nanometre dalga boyunda bir UV transillüminatör ile görüntüleri kaydedin. Son adım olarak, Coomassie ile boyanmış jel görüntülerini ProQ Emerald boyalı jel görüntüleri ile karşılaştırın.

Kontrol örneği ile PGA'nın F işlemi karşılaştırıldığında, enzimatik deglikozilasyon sonrası protein migrasyonundaki değişiklikler görülebilir. n-glikanlarını uzaklaştırmak için Deglikozilasyon karışımı işlemi ve n ile O glikanlarını uzaklaştırmak için uygulanan işlem sonrası, ek glikozidaz ile sindirim yapıldığında boyutunda daha fazla bir azalma görülmez. Kütledeki değişimin yanı sıra, glikanlar uzaklaştırıldıkça bantlar daha keskin hale gelir.

17 kilodalton markörünün altında seyreden bir bant, muhtemelen tamamen deglikozile edilmiş HCG beta polipeptidini temsil eder. Beş ila yedi arasındaki şeritler, Glyco'ya karşılık gelen bantları göstermektedir. Diğer bantlar, eksik deglikozilasyondan veya HCG beta örneğinde bulunan tanımlanmamış çoklu proteinlerden kaynaklanmış olabilir.

Zümrüt yeşili reaktif, bir protein molekülünde bulunan tüm glikanları oksitler ve boyar. Bu nedenle, HCG beta enzimatik olarak deglikozillendikçe sinyal şiddeti azalır. Üçüncü ve dördüncü şeritteki kalıntı sinyal, kullanılan enzimlere dirençli olan glikan motiflerinin varlığını göstermektedir.

Dördüncü şeritte ek glikozat kullanılmıştır. Birkaç fazla şeker kalıntısı uzaklaştırılır. Protein migrasyonu aynıdır, ancak boyamada hafif bir yoğunluk azalması görülebilir.

Dirençli şeker kısımları tüm protein türlerinde mevcut değildi. Bazı bantların emerald Green ile tespit edilememesi, bunların kapsamlı bir şekilde deglikozile olduğunu göstermiştir. Ek veriler, HCG beta'nın heterojen şekilde glikozile olduğu sonucunu desteklemektedir. İkinci şeritteki alt bant, emerald green görüntüsünde soluktur.

İkinci şeritteki üst bandın parlak olması birçok GLYCAN grubunun hâlâ mevcut olduğunu gösterse de bu veriler, fare hücrelerinde eksprese edilen rekombinant HCG beta'nın glikozilasyonun doğal heterojenliği nedeniyle birden fazla glikoform içerdiği sonucunu desteklemektedir. Bu prosedürün ardından, doluluk oranı nedir? Glikozilasyonun kapsamı nedir veya glikanların ince yapısı nasıldır? gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla kütle spektrometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, glikoproteinler üzerindeki N-bağlantılı glikanların enzimatik deglikozilasyonu ve analizi için glycosylate'in nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Protein boyama bölgeleri, yalnızca deglikozilasyon diğer proteinler için moleküler kütlede önemli bir kaymaya yol açtığında yararlı olduğundan, tespit yönteminin seçimi zor olabilir.

Deglikozilasyon sonrası anormal migrasyonlar gözlemledik ve migrasyondaki herhangi bir değişikliğin, proteinin deglikozile olduğunun kanıtı olduğunu saptadık.