Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bakterilerin sıvı ortamlardan ayrılmasını kolaylaştırmak için onlara yapışkan özellikler kazandırmaktır. Bu işlem, öncelikle karmaşık genetik düzenlemeleri devre dışı bırakmak ve yapışkan polimerlerin kolay ve kitlesel üretimini sağlamak için sentetik bir curli tasarlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, sentetik düzeneğin verimliliğinin hızlı bir şekilde tahmin edilmesine olanak tanıyan polistiren üzerindeki yapışkan bakteriler görselleştirilir ve miktarları belirlenir.

Ardından, cama yapışmış bakteriler konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Biyofilmi doğrudan gözlemlemek ve yapısı hakkında bilgi edinmek amacıyla; hem yapışma miktarı, yüzde ölçümü hem de mikroskobik gözlemlerle, sentetik düzeneği taşıyan suşta yapışmanın önemli ölçüde arttığını gösteren sonuçlar elde edilir. Sentetik biyoloji yaklaşımının geleneksel klonlama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, uygun sinyallere sahip ve yalnızca kesin olarak gerekli olan genleri taşıyan konstrüktlerin çok hızlı bir şekilde elde edilebilmesidir.

Bu yöntem, radyoaktif atıklardan metal yüklü bakterilerin uzaklaştırılması zorluğu gibi biyoremediasyon alanındaki temel bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genellikle, genetik düzenleyici sinyaller ve veri tabanı yönetimi hakkında temel bilgi gerektirdiğinden, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler zorluk yaşayabilir. Görsel gösterim, biyofilmlerin kırılganlığı nedeniyle öğrenilmesi oldukça zor olan biyofilm kantifikasyonu ve görselleştirmesi adımlarına odaklanacaktır.

Sentetik carron tasarımındaki ilk adım, curly genlerinin genetik organizasyonunu belirlemek ve bunların endojen, transkripsiyonel ve translasyonel sinyallerini lokalize etmektir. Bu işlem, REON DB veya eco gene gibi özelleşmiş veritabanları kullanılarak gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, curly sentezi için kesinlikle gerekli olan beş genin seçilmesidir; CSGB ve CSGA fiber monomerlerini kodlarken, C-S-G-E-C-S-G-F ve CSGG kıvrılma salgı kompleksini kodlar; seçilen diziler veritabanından FASTA formatında çıkarılır, veri yönetimi ve in silico ön analizler, C-S-G-G-F-E kümesi E. coli genomunda antisense olduğu için clone manager yazılımı ile gerçekleştirilir.

Bu dizinin ters tamamlayıcısına dönüştürülmesi gerekmektedir. Klon yöneticisi araçlarındaki "operations process molecule invert molecule" işlemini kullanın, ardından ligate fonksiyonunu kullanarak C-S-G-E-F-G dizisini C-S-G-B-A'nın arkasına yapıştırın. Sonrasında, C-S-G-B-A-E-F-G iCal dizisinin önüne uygun PRCN promotörünü ekleyin.

RCN lokusu, nikel ve kobalt detoksifikasyonundan sorumlu bir FLX pompası olan RCNA ile onun konjuge metal düzenleyicisi RCNR'yi kodlar. Kobalt veya nikel yokluğunda, represör RCNR, DNA üzerindeki RCNR kutusuna bağlanır ve aşağı akış genlerinin tam transkripsiyonel aktivasyonunu engeller. Hücre içi kobalt veya nikel konsantrasyonu yükselirse, kobalt veya nikelin RCNR proteinine bağlanması, represörün promotöre sabitlenmesini engeller ve seçilen beş kıvrımlı genin promotör kontrolü altına girmesiyle P-R-C-N-A'nın transkripsiyonel aktivitesi artar.

PRCN curly'nin kobalt ve nikel varlığında aşırı üretileceği öngörülmektedir. Ardından, CS gba DNA dizisinin ilk ATG'sinin önüne mükemmel bir ribozom bağlanma bölgesi veya RBS ve C-S-G-E-F-G dizisinin önüne ikinci bir mükemmel RBS ekleyerek transkripsiyonel sinyalleri optimize edin. iGEM standartlarına uyması için cihaz, EcoRI ve XhoI için kısıtlama bölgeleri içeren standart bir biobrick öneki ile daha sonraki montajı kolaylaştırmak için SpeI ve PstI için kısıtlama bölgeleri içeren bir son ek ile çevrelenmelidir.

Bio brick parçasının kendisi herhangi bir ECO R one, PST one SPE one ve X-bar R one tanıma bölgesi içermemelidir. Bu nedenle, söz konusu bölgeler sessiz mutasyon değişiklikleriyle ortadan kaldırılmıştır; cihazın in silico kısıtlama analizi, CSGA dizisinde bir PST one bölgesi, RCNR dizisinde bir PST one bölgesi ve CSGE geninde bir ECO R one bölgesi olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu bölgeler sessiz mutasyonlarla modifiye edilmiştir.

Sentetik operon tasarımı tamamlandıktan sonra, klon yönetici yazılımını kullanarak bir translasyon simülasyonu gerçekleştirin. Vahşi tip curly proteinleri ile sentetik operon tarafından kodlanan proteinler arasındaki mükemmel homolojiyi doğrulamak için blast dizi hizalama programını kullanın; bu prosedüre 24 kuyucuklu bir polistiren plakanın her bir kuyucuğuna 2 mL %0,2 glikoz içeren M 63 minimal besiyeri ekleyerek başlayın. Her kuyucuğu, gece boyunca inkübe edilmiş bakteriyel kültürden 10⁶ hücre ile inoküle edin. Bakterileri 30 °C'de, çalkalamadan 18 ila 48 saat boyunca büyütün; 24 kuyucuklu plakanın her bir sütunu bir modaliteyi temsil eder.

Gerektiğinde uygun miktarda kobalt ve antibiyotik eklenir. İlk üç satır, üç tekrarın ortalaması alınarak A yapışkan bakterilerini miktarlandırmak için kullanılır. En soldaki son satır, 18 ila 48 saat sonra kristal viyole boyaması ile biyofilmi görselleştirmek için kullanılır; 24 kuyucuklu plakanın ilk üç satırındaki her bir kuyucuktan planktonik hücreleri içeren süpernatant geri kazanılır ve süpernatant bir hemoliz tüpüne aktarılır.

Her bir kuyucuğu bir mililitre M 63 besiyeri ile dikkatlice durulayın ve yıkama sıvısını ilk süpinat ile birlikte hemoliz tüpüne çekin. Bu havuz, S olarak adlandırılan yüzer hücreler olarak tanımlanır. Mikroplakadaki kuyucukların dibi yapışkan hücrelerle kaplıdır. Biyofilmi geri kazanmak için her birine bir mililitre M 63 ekleyin.

Pipet ucuyla kazıyın, ardından pipetle yukarı aşağı çekerek biyofilm fraksiyonunu yeni bir hemoliz tüpüne aktarın. Tüpü 15 saniye boyunca vorteksleyin. Biyofilm fraksiyonunu hemoliz tüplerinde toplayın.

Bu havuz, yüzeye tutunmuş hücreleri temsil eder. Hemoliz tüplerindeki süpernatant ve biyofilm fraksiyonunun 200 µL'sini 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Yüzeye tutunmuş ve yüzen bakteri sayısını 600 nm'deki optik yoğunluktan tahmin edin. Her bir modalite için yapışma yüzdesi, B x 100 / (3 x S + B) formülü kullanılarak hesaplanır. 24 kuyucuklu plakanın yalnızca son sırasındaki biyofilmi görselleştirmek için, bu kuyucuklardaki plankton hücrelerini uzaklaştırın.

Plakanın tabanında gelişen biyofilm tabakasını durulamak için her kuyucuğa bir mililitre M 63 ekleyin. Açık bırakılan plakayı 80 °C'de bir saat boyunca kurutun; bir saat sonra, her kuyucuğa 100 µL %20 kristal viyole ekleyin ve ardından su ile kapsamlı yıkamalar yapın. Bu protokol için floresan bir şasi gereklidir.

Sentetik curli taşıyan plazmid için uygun bir konakçı, ana suş MG 1 16 55'ten gözlemlenebilir bir fark olmaksızın konstitütif olarak yeşil floresan protein eksprese eden e coli SCC one suşudur. S 23 suşunu elde etmek için konakçı suşu, sentetik curli taşıyan bir puck 57 plazmidi ile transforme edin. Kontrol suşunu elde etmek için konakçı suşu, kontrol plazmidi puck 18 ile transforme edin.

S 23 ve S 24 suşlarının ön kültürlerini 30 °C'de gece boyunca büyütün. Ertesi gün, glikoz ve ampisilin ile takviye edilmiş M 63 besiyerine, bir Petri kabına 20 mL M 63 besiyeri ekleyin ve ardından Petri kaplarındaki 15 mL M 63'ü 100 µL ön kültür ile inoküle edin. Uygun konsantrasyonda kobalt ekleyin ve kobalt içermeyen negatif kontrolü unutmayın.

Her bir Petri kabına üç adet dikdörtgen cam lamel yerleştirin. Kapları, çalkalamadan, 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Bakteriler, sonraki günlerde floresan mikroskobu altında doğrudan gözlemlenebilir.

Numunenin kurumasını önlemek önemlidir, bu nedenle aşağıdaki adımlar dikkatli ancak hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Her bir lameli Petri kaplarından çıkarın ve dikkatlice süzün. Konfokal gözlem için tüm bakteri kalıntılarını temizlemek amacıyla, alt yüzeyi %70 ethanol emdirilmiş küçük bir pamuklu çubukla dikkatlice temizleyin.

Lam üzerine, biofilm yüzeyi yukarı bakacak şekilde lamel yerleştirin. Biofilm daha sonra, cam lam üzerine vernik ile sabitlenen daha büyük bir lamel ile örtülür.

Biyofilm şimdi alt yüzde kalacak şekilde düzeneği ters çevirin. Bu deneyde düzeneği konfokal lazer mikroskobunun altına yerleştirin. CT mikro platformu içerisinde bir Zeiss LSM five 10 meta konfokal lazer mikroskobu kullanılmıştır.

40x yağ daldırma objektifini seçin. GFP'yi 488 nanometrede uyaracak ve bakteriyel floresansı 500 ila 600 nanometre aralığında toplayacak şu ayarları kullanın. Görüntüleri elde etmek için 40x yağ daldırma objektifini kullanın.

Lazer taramalı konfokal modunda, biyofilmlerin katı yüzeyden büyüme ortamı ile olan ara yüze kadar olan genel üç boyutlu yapılarını bir mikronluk adımlarla tarayın.

Bir maus yazılımı ile üç boyutlu projeksiyonlar gerçekleştirin, istatistiksel boylamasına kesitler boyunca ortalama C değerinin analizi ile biyofilm kalınlığını belirleyin. Biyofilmin kantifikasyonu ve biyohacimler, konfokal Z yığınlarından çıkarılabilir. Metallere yanıt olarak curly'yi aşırı üretmek üzere mühendisliği yapılmış e coli'nin yapışma yetenekleri basit yöntemlerle değerlendirilebilir.

Örneğin, 24 kuyucuklu cilalı Irene plaklarında kristal viyole boyama, mor renk yoğunluğundaki farkla gösterildiği üzere, her kuyucuğun tabanındaki biyofilm oluşumunun hızlıca görselleştirilmesini sağlar. Yabani tip suşun, mühendislik ürünü suşa göre daha az yapışkan olduğu görülmektedir. Kantitatif bir yöntem ise, çeşitli kobalt konsantrasyonları ile yabani tip ve mühendislik ürünü suşların polistirene yapışma yüzdelerini ölçmektir.

Bu grafikte sunulan sonuçlar, kobalt yokluğunda mühendislik ürünü suşun yapışma yüzdesinin, yabanı tip suşunkinden 1,5 kat daha yüksek olduğunu ortaya koymaktadır. Ayrıca, artan kobalt konsantrasyonlarının varlığında yapışmada belirgin bir güçlenme gözlemlenmiş; 25 µM veya 50 µM kobalt konsantrasyonuna sahip ortamlarda, mühendislik ürünü hücrelerin yapışma yüzdeleri sırasıyla %30 ve %40'a ulaşmıştır. Yapışma yetenekleri, cam lamlar üzerinde büyütülen GFP etiketli bakterilerle mikroskopi kullanılarak da karşılaştırılabilir; siyah arka plan üzerindeki yeşil bakterilerin epi-floresan mikroskopi gözlemleri, mühendislik ürünü suşun bir biyofilm oluşturduğunu, yabanı tip suşun ise oklarla belirtilen yalnızca mikro koloniler oluşturduğunu göstermektedir.

Konfokal mikroskopi analizi, biyofilmin üç boyutlu yapısına genel bir bakış sağlar. Üstten görünüm rekonstrüksiyonları A panellerinde, yandan görünüm rekonstrüksiyonları ise B panellerinde gösterilmiştir. Sonuçlar, mühendislik ürünü suşun daha yapışkan olduğunu ve yabanı tipe göre daha yoğun ve kalın bir biyofilm oluşturduğunu doğrulamaktadır. Bu prosedür uygulanırken, örneğin radyoaktif atık sular bağlamında modifiye edilmiş e coli veya occus ants'in biyotemsizleme potansiyelini araştırmak için operasyon tasarımını tekrar kontrol etmek önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, klon yönetici yazılımı kullanarak sentetik bir operonun nasıl tasarlanacağı ve bakteriyel suşların ifadesinin nasıl hızlıca nicelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Sentetik genler ve genetiği değiştirilmiş organizmalarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken, transforme edilmiş bakterilerin otoklavlanması gibi mevcut yasalara ve önlemlere uygun hareket edilmelidir.