Eşzamanlı Gerilim-kelepçe ve Amperometri ile Dopamin Film Tek Hücre Ölçümü
21 Kasım 2012
Amperometrik tekniği spontan dopamin oksitlenmeye tarafından üretilen oksidatif akımı algılayarak tek bir hücreden dopamin salınımını ölçer. Eşzamanlı gerilim kelepçe ve amperometri metodolojisi dopamin taşıyıcısı ve dopamin ters taşıma Bu faaliyetin düzenleyici rolünün genel "faaliyet" arasındaki mekanistik ilişki bulunmaktadır.
Bu prosedürün amacı, DAT aracılı D salınımını ölçmek için eş zamanlı patch clamp ve pirometri kullanılarak voltaj klemplenen bir nöronda dopaminin ters taşınımını ölçmektir. Bu işlem, öncelikle pirometrik elektrodun bütünlüğünün dopamin ile test edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, pirometrik elektrodun hücre yakınına yerleştirilmesi ve bir patch pipeti ile nöronun whole cell patch kaydının alınmasıdır.
Ardından, hücrenin voltajı patch pipeti ile kontrol edilir ve hücre tarafından salınan DAT aracılı dopamin, eş zamanlı olarak pirometrik bir elektrotla kaydedilir. Son adım, DAT blokerini eklemek ve dopamin taşıyıcısı tarafından spesifik olarak iletilen akımın çıkarılmasına olanak sağlamak için tüm hücre ve pirometri akımlarını yeniden kaydetmektir. Bu tekniğin önemi, dopaminerjik nöronun voltajı eş zamanlı olarak kontrol edilirken, dopamin taşıyıcısı aracılığıyla dopaminin ters taşımasını ölçebilme yeteneğidir.
Eş zamanlı patch clamp ve barometri kayıt sistemi, sistem için bir DC ışık kaynağı oluşturmak amacıyla mükemmel DIC optiklere ve uzun çalışma mesafeli bir lense sahip ters bir mikroskop gerektirir. Mikroskop ışık kaynağını, düşük elektriksel gürültü sağlamak için bir araç aküsüne bağlayın. Hidrolik mikro manipülatörler, konfigürasyonumuzdaki gürültü seviyelerine belirgin bir katkıda bulunmadıkları için tercih edilmiştir.
Voltaj kenetleme ve tüm hücre kaydı için sağ elli bir manipülatör, pirometri için ise sol elli bir manipülatör kullanılır. Tüm hücre kaydı için elektrodu hazırlamak amacıyla, P 2000 çekici ile bir kuvars pipet çekin. Tipik olarak, üç ila dört mega ohm direnci olan bir pipet kullanırız.
Ardından, elektrodu bir milimolar dopamin içeren pipet çözeltisiyle doldurun. Daha sonra elektrodu, sağ manipülatör üzerindeki pipet tutucuya monte edin. Dopamin içeren pipet çözeltisinin bulunduğu kabı alüminyum folyo ile sardığınızdan ve kullanılmadığı zamanlarda buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun.
Dopamin oksitlenebildiği için, çözeltiyi buz üzerinde ve ışıktan korunmuş şekilde tutmak oksidasyon hızını azaltacaktır. Gümüş teli elektrot tutucuya yerleştirin, ardından parametrik adaptörü elektrot tutucuya takın. Sonrasında, trikot elektrodu gümüş telle temas edecek kadar cıva ile doldurun.
Elektrot adaptöre monte edildiğinde, ucun temiz ve sağlam olduğundan emin olmak için pro CFE düşük gürültülü karbon fiber ve parametrik elektrodu mikroskop altında inceleyin. Karbon fiberin ucunu hasardan korumak için karbon fiberin uzak ucundan tuttuğunuzdan emin olun. Ardından pro CFE Tric elektrodu monte edin.
Ardından, tric elektrodun bütünlüğünü incelemek için monte edilen elektrodu sol hidrolik manipülatöre yerleştirin. Elektrodu, dış çözelti içeren cam tabanlı bir Petri kabına indirin. Dopamin yokken bazal akımı kaydedin.
Ardından, kaba 1 milimolar dopamin çözeltisinden 10 µL ekleyin. İyi bir amperometrik elektrot, oksidatif akımda bir artış kaydetmelidir. Deneylerden önce ve sonra amperometrik elektrodun bütünlüğünü kontrol ettiğinizden emin olun.
Bu prosedürde, cam tabanlı Petri kabında bulunan dopamin nöronlarını veya dopamin taşıyıcısını eksprese edecek şekilde mühendisliği yapılmış hücreleri inkübatörden çıkarın. Hücreleri veya dopamin nöronlarını ılık dış çözelti ile nazikçe üç kez yıkayın. Hücreleri görüntülemek ve deneyi gerçekleştirmek için cam tabanlı Petri kabını mikroskop tablasına yerleştirin ve hücreleri net bir şekilde görüntülemek için doğru odak noktasını bulun.
Ardından, patch elektroduna pozitif basınç uygulayın. Bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, her iki elektrodu da mikro manipülatörler yardımıyla nazikçe çözeltinin içine ve hücreye daha yakın konuma getirin. Sonra, amperimetrik elektrodu hücrenin sol tarafına, patch elektrodunu ise sağ tarafına yerleştirin.
Yama elektrodu hücreye değdiğinde, hücre üzerinde bir giga sızdırmazlık (giga seal) oluşturmak için ağızla veya şırıngayla hafif vakum uygulayın. Ardından, tüm hücre konfigürasyonuna ulaşmak için vakumla sızdırmazlığı bozun ve dopamin içeren iç çözeltinin hücre içine diyaliz edilmesi için beş ila sekiz dakika bekleyin.
Ardından, pipet aracılığıyla hücre membran voltajını -40 mV tutma potansiyelinden -60 ve +100 mV arasında değiştirerek DAT aracılı akımları kaydedin. Spesifik DAT aracılı dopamin akısını belirlemek için amperi, bir DAT antagonistinin yokluğunda ve varlığında kaydedin. Spesifik DAT aracılı net akım, DAT antagonisti varlığında kaydedilen izlerin, antagonist olmadan kaydedilen amper izlerinden çıkarılmasıyla belirlenir.
Tric akımlarındaki yukarı yönlü sapma, burada gösterilen dopamin dış akışına karşılık gelir. Tüm hücre yama modunda, pipeti 2 mM dopamin içeren bir hücrede, -40 mV tutma potansiyelinden -60 ile +100 mV arasında 20 mV'luk adımlarla membran voltajı değiştirilerek kaydedilen DAT aracılı akımlar. Burada, tüm hücre akımıyla eş zamanlı olarak elde edilen amperometrik akım yer almaktadır.
Bu videoyu izledikten sonra, voltaj klempli bir nöronda dopamin taşıyıcısı aracılığıyla dopaminin ters taşınımının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Deneylerden önce ve sonra parametrik elektrodun bütünlüğünü kontrol etmeyi unutmayın ve antagonist varlığında kaydedilen izleri, antagonist olmadan kaydedilen izlerden çıkarmayı ihmal etmeyin.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, eş zamanlı patch clamp ve pirometri kullanarak nöronlarda dopaminin ters taşınımını ölçmeye yönelik bir tekniği açıklamaktadır. Bu yöntem, nöronun voltajı kontrol altındayken dopamin taşıyıcı (DAT) aracılı salınımın değerlendirilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Elektrofizyoloji
- Nörotransmitter dinamikleri
Arka Plan
- Dopamin, çeşitli beyin fonksiyonlarında yer alan kritik bir nörotransmitterdir.
- Dopamin taşıyıcısı, dopamin seviyelerinin düzenlenmesinde kilit bir rol oynar.
- Ters taşıma mekanizmalarını anlamak, dopaminerjik sinyal iletimine dair içgörüler elde etmek için gereklidir.
- Bu teknik, artırılmış doğruluk için voltaj kenetlemesini amperometrik ölçümlerle birleştirir.
Çalışmanın Amacı
- Voltaj klempli nöronlarda dopaminin ters taşınımını ölçmek.
- DAT aktivitesi ile dopamin salınımı arasındaki ilişkiyi incelemek.
- Dopaminerjik nöron fonksiyonunun gerçek zamanlı olarak çalışılması için bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Pirometrik elektrodun bütünlüğünün dopamin ile test edilmesi.
- Bir patch pipeti kullanılarak nöronun whole cell patch moduna getirilmesi.
- Hücre voltajının patch pipeti ile kontrol edilmesi.
- Pirometrik elektrot kullanılarak DAT aracılı dopamin salınımının kaydedilmesi.
Ana Sonuçlar
- Voltaj klempleme sırasında dopamin salınımının başarılı bir şekilde ölçülmesi.
- DAT blokerlerinin dopamin transportu üzerindeki etkisinin gösterilmesi.
- Dopamin transportunun düzenleyici mekanizmalarına dair içgörüler sağlanması.
- Nöronal dopamin dinamiklerini incelemek için kullanılan yöntemin doğrulanması.
Sonuçlar
- Bu teknik, dopaminin ters taşınmasını etkili bir şekilde ölçer.
- Voltajın eş zamanlı kontrolü, DAT fonksiyonunun anlaşılmasını geliştirir.
- Bu yöntem, dopaminerjik sinyal iletimi üzerine yapılacak ileri çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Bu yöntem, voltaj kontrolü altında dopamin taşıyıcısı aracılığıyla dopamin çıkışının doğrudan ölçülmesini sağlayarak, nöropsikiyatrik ilaç keşfi ile ilgili taşıyıcı fonksiyonuna dair mekanistik bilgiler sunar. DAT aracılı salınımı gerçek zamanlı olarak izole ederek, hedef doğrulamasını destekler ve hastalık modellerindeki dopaminerjik sinyallezme ilişkin hipotezlerin risklerini azaltır. Bu yaklaşım, taşıyıcı aktivitesini nörotransmitter dinamiklerine bağlayarak erken keşif aşamasındaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Canlı nöronlarda fonksiyonel hedef etkileşimini doğrulamak için dopamin taşıyıcısının eflluks mekanizmasını sorgular.
- Operasyonel Değer: Membran potansiyelini taşıyıcı aracılı dopamin akışı ile ilişkilendirmek için eş zamanlı elektrofizyolojik ve amperometrik kayıt imkanı sağlar.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değeri: Kontrollü voltaj basamakları altında DAT bağımlı dopamin salınımını yansıtan kantitatif, zamana bağlı oksidatif akım okumaları üretir.
- Operasyonel Değeri: Taşıyıcı aracılı efluksun ölçümü için tekrarlanabilir bir analiz formatı oluşturarak DAT modülatörleri için bileşik taramasını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: DAT eflluks aktivitesini hücre dışı dopamin homeostazı ile ilişkilendirerek, taşıyıcı disfonksiyonunun rol oynadığı hastalık modellerine ışık tutar.
- Operasyonel Değer: Dopamin taşıyıcı fonksiyonunun genetik veya farmakolojik perturbasyonlarını değerlendirmek için hastalıkla ilişkili bir sistem sunar.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, lider bileşik belirleme çalışmalarından önce dopamin taşıyıcı hedeflerinin mekanistik risklerinin azaltılmasına olanak tanıyarak erken keşif iş akışlarına uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Dopaminerjik nöronlarda taşıyıcı tersinme mekanizmalarının hipotez testlerini ve yolakların açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Bileşiklerin DAT aracılı efluks üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneye hazır, kantitatif çıktılar sunar.
- Analitik: Farmakolojik çıkarma yoluyla DAT'ye özgü sinyalleri izole etmek için eş zamanlı tüm hücre akımı ve amperometrik ölçümler sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Voltaj kontrollü nöronal sistemlerde dopamin disregülasyonunu modelleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla nöronal model veya hastalık bağlamında taşıyıcı fonksiyonlarını değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Fizyolojik voltaj kontrolü altında eflluks aracılı dopamin salınımını doğrudan ölçerek hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Senkronize patch clamp ve amperometri yoluyla assay standardizasyonunu teşvik ederek nörotransmitter akış ölçümlerindeki değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: Taşıyıcı etki mekanizmasını netleştirerek go/no-go kararlarını iyileştirir ve mekanistik yanlış anlaşılmalardan kaynaklanan geç aşama kayıplarını azaltır.
- Portföy Etkisi: Fonksiyonel eflluks modülasyon verilerine dayanarak DAT hedefli bileşiklerin riskle uyarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Elektrot bütünlüğünü ve sinyal sadakatini korumak için elektrofizyoloji, amperometri ve nöronal kültür konularında uzmanlık gerektirir.
- Hidrolik manipülatörler, çift Axopatch 200B amplifikatörler ve eş zamanlı kayıt için karbon fiber elektrotlar dahil olmak üzere düşük gürültülü enstrümantasyona dayanır.
- Deneyler arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak için voltaj protokollerinin ve antagonist çıkarma yöntemlerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı nöronal modeller için, özellikle dopamin taşıyıcı ekspresyon seviyeleri ve membran sağlığı ile ilgili adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Dopamin çözeltisinin oksidasyonu gibi, deneyler öncesinde ve sonrasında koruyucu taşıma ve baz hattı doğrulamasını gerektiren pratik kısıtlamaları kapsar.
