Durduruldu-Akış Spektrofotometri kullanarak Flavin-Bağımlı monooksijenaz ve indirgeyici ve Oksidatif Yarı-Tepkime İzlenmesi

Bu prosedür, SID A'nın farklı spektral formlarını saptamak ve hızları ölçmek için bir durdurulmuş akış (stopped flow) cihazı kullanır. SID A tarafından katalize edilen reaksiyon, FAD'nin redüktif ve oksidatif yarı reaksiyonlarına ayrılabilir. Okside flavin N-A-D-P-H'ye bağlanır ve indirgenmiş flavin ile NADP oluşturmak üzere reaksiyona girer; moleküler oksijenin reaksiyonu ve ornitinin bağlanması ise C four oluşumuyla sonuçlanır.

Ornitinin hidroksilasyonundan sonra oluşan bir hidroksi flavin, okside enzimi oluşturmak için su kaybeder. NADP⁺ katalitik döngü boyunca bağlı kalır ve salınan son substrattır. Stopped flow cihazı, düşük hacimli reaktiflerin hızlıca karıştırılmasını kolaylaştırır ve kayıt alır.

Zamana bağlı spektral değişimler spektrofotometresi, bir enzim katalizli reaksiyonun, özellikle de geçici ara ürünlerin oluşum ve bozunma hızlarının ölçülmesine olanak tanır. Laboratuvarımdan Rita Robinson ve Enviro Romero, model sistem olarak flavin monooksijenaz kullanarak A setindeki bu deneyleri gösterecekler. 500 mililitrelik, içinde manyetik karıştırıcı bulunan bir büchner balonuna 250 mililitre 100 milimolar potasyum fosfat tamponu dökün.

Balonu kauçuk bir tıpa ile kapatın, ardından bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin ve balonun kısa tüpünü bir Schlenk hattına bağlayın. Tampon çözeltiyi, oda sıcaklığında karıştırma eşliğinde bir saat boyunca vakum altında gazdan arındırın ve ardından argon ile yıkayın. Bu işlemi beş kez tekrarlayın.

Son olarak balonu 10 saniye boyunca argon ile yıkayın. Balonu vakum manifoldundan ayırın ve eldiven kutusunun içine yerleştirin. Balon açıkken kuvvetli bir şekilde karıştırmaya devam edin.

Rezervuar şırıngalarını mililitrede 18,13 ünite glukoz oksidaz ve 100 milimolar glukoz çözeltileri ile doldurun. Şimdi sürüş valflerini yükleme konumuna getirin. Sürüş şırıngalarını doldurun.

Ardından, F valfini sürüş (drive) konumuna getirin. Pro veri kontrol yazılımını kullanarak "stop şırıngasını boşalt" (empty the stop syringe) seçeneğine tıklayın, ardından ilgili sürüş ramini manuel olarak kaldırarak tampon çözeltiyi F sürüş şırıngasından akış devresine itin. Diğer üç sürüş şırıngasıyla aynı işlemi tekrarlayın ve bir saat boyunca dengelemeye (equilibrate) bırakın.

Şimdi rezervuar şırıngalarını yeniden doldurun ve durdurulmuş akış sisteminin yıkama işlemini tekrarlayın. Oksijenle doyurulmuş tampon hazırlamak için çözeltiyi bir saat boyunca karıştırarak %100 oksijen ile köpürtün.

Ardından kısa iğneyi flakondan çıkarın ve 10 saniye bekleyin. Uzun iğneyi çıkararak devam edin ve kapalı flakonu glove box içerisine yerleştirin. N-A-D-P-H çözeltisi için.

Bir miligram N-A-D-P-H içeren 1,5 mililitrelik bir einor tüpünü glove box içerisine yerleştirin. 300 µL anaerobik, 100 mM potasyum fosfat tamponunda (pH 7,5) çözün.

N-A-D-P-H konsantrasyonunu belirlemek için 30 µL alın. Enzim stokundaki oksijeni uzaklaştırmak için çözeltiyi, manyetik karıştırıcı çubuk, tapa ve alüminyum mühür içeren 25 mL'lik bir viale aktarın. Buz üzerine yerleştirin.

Bir schlink hattına bağlayın, ardından 20 dakika boyunca vakumla gazını alın ve ardından argon ile yıkayın. Son olarak, vial'i 10 saniye boyunca argon ile yıkayın ve vakum manifoldundan ayırın. Vial'i glove box içerisinde buz üzerine yerleştirin.

Pro data kontrol yazılımının kontrol paneli penceresinde; fotodiyot dizisi, harici tetikleyici ve logaritmik ölçeği seçin. Ayrıca pro data görüntüleyici yazılımını başlatın ve veri dosyalarının saklanacağı dizini tanımlayın.

Şimdi rezervuar şırıngaları C ve F'deki çözeltiyi, anaerobik 100 millimolar potasyum fosfat tampon pH 7.5 ile değiştirin. C ve F valflerini sürücü konumuna getirin. Pro data kontrol yazılımında stop şırıngasını boşalt (empty the stop syringe) seçeneğine tıklayın.

Ardından, ilgili itici ramları manuel olarak kaldırarak her iki itici şırıngadaki tamponu akış devresinden geçirin. C ve F rezervuar şırıngaları ile yıkama işlemini üç kez daha tekrarlayın. Glikoz oksidazın akış devresinden tamamen uzaklaştırıldığından emin olmak için pro veri kontrol yazılımındaki baseline seçeneğine tıklayın.

Rezervuar şırıngası F'deki çözeltiyi enzim çözeltisiyle değiştirin. F valfini sürüş konumuna getirin. Pro data kontrol yazılımında stop şırıngasını boşalt seçeneğine tıklayın.

İlgili itici pistonu manuel olarak yukarı kaldırarak, enzim solüsyonunu F sürücü şırıngasından akış devresine doğru itin. Kazanım süresini 60 saniye olarak ayarlamak için pro veri kontrol yazılımına geri dönün. Her iki sürücü şırınganın ilgili solüsyonlarla dolu olduğunu ve itici pistonların sürücü şırınga pistonlarıyla temas halinde olduğunu doğrulayın.

Her iki vanayı da sürüş konumuna getirin ve sürüşü gerçekleştirmek için pro data kontrol yazılımındaki acquire (edin) seçeneğine tıklayın. Sürüşlerden elde edilen A 452 nanometre değerini kullanarak enzimin oksitlenmiş formunun spektral verilerini üç tekrar halinde edinin. Karıştırma öncesindeki enzim konsantrasyonunu belirleyin ve dört mililitre N-A-D-P-H çözeltisi hazırlayın.

1,5 kat daha derişik olan rezervuar şırıngası C'yi N-A-D-P-H çözeltisiyle doldurun ve daha önce gösterildiği gibi stop şırıngasını üç kez boşaltıp yeniden doldurun. Şimdi, enzimin indirgenmesi sırasında spektrumlar elde edin; akış devresindeki içerikleri anaerobik 100 millimolar potasyum fosfat tamponu pH 7.5 ile yıkayarak uzaklaştırın. Ardından, pro veri kontrol yazılımındaki baseline (temel hat) seçeneğine tıklayın.

Ardından, 200 µL enzim stok çözeltisini 1000 µL anaerobik, 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7,5) ile karıştırın. Rezervuar şırınga A'daki çözeltiyi enzim çözeltisiyle değiştirin.

Pro veri kontrol yazılımında A valfini sürücü konumuna getirin. Şırıngayı boşaltma butonuna (stop syringe empty) tıklayın. İlgili sürücü pistonunu manuel olarak yukarı kaldırarak, enzim çözeltisini A sürücü şırıngasından akış devresine doğru itin.

Gecikme süresini 0,5 saniye ve kazanım süresini 60 saniye olarak ayarlayın. Tüm sürücü şırıngalarının ilgili çözeltilerle dolu olduğunu ve sürücü pistonlarının şırınga pistonlarıyla temas ettiğini doğrulayın. Ardından tüm sürücü valflerini sürücü konumuna getirin ve pro data kontrol yazılımında acquire düğmesine tıklayın.

Enzimin okside formunun spektral verilerini üç tekrarlı olarak elde edin. Ardından, B rezervuar şırıngasındaki çözeltiyi, A şırıngasındaki enzim çözeltisinden 1,5 kat daha konsantre bir N-A-D-P-H çözeltisiyle değiştirin. B valfini sürüş konumuna getirin ve kontrol paneli penceresinde daha önce gösterildiği gibi durdurma şırıngasını üç kez boşaltıp yeniden doldurun.

Gecikme süresini 0,5 saniye olarak ayarlayın. 20. saniyedeki bir veri toplama işleminde, rezervuar şırıngasındaki çözeltiyi oksijenle zenginleştirilmiş tampon çözelti ile değiştirin. C valfini sürüş konumuna getirin.

Pro data kontrol yazılımında üç kez durulama yapın. Gecikme süresini 15 saniye, ölçüm süresini ise 900 saniye olarak ayarlayın. Stopped-flow cihazında, tamamen indirgenmiş enzimin yeniden yükseltgenmesi sırasında spektrumları almaya devam edin.

SID A'nın N-A-D-P-H ile anaerobik indirgenmesi, 452 nm'deki absorbansı kullanarak flavinin redoks durumundaki değişiklikler ölçülerek takip edilebilir. Spektral değişiklikler, oksitlenmiş SID A'dan tam olarak indirgenmiş SID A'nın son spektrumuna kadar zamanla kaydedilir. Bu enzimatik adımın hızı, verilerin uygun denkleme uydurulmasıyla belirlenebilir. Oksidasyon hızı ve reaksiyon ara ürünleri, bu reaksiyonda AF Sid A kullanılarak stopped flow cihazının çift karıştırma moduyla da belirlenebilir. C4A hidroksi flavin ara ürünü 380 nm'lik bir lambda max değeriyle net bir şekilde saptanırken, oksitlenmiş enzimin lambda max değeri 450 nm'dir.

Bu teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde dört ila altı saat içinde tamamlanabilir. Çözeltilerin anaerobik olduğundan emin olmayı unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, hızlı kimyasal yöntemler gibi daha ileri aşama deneylerden bağımsız olarak, FLA'nın hem göreceli hem de ülseratif iyonunun nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Quentin, ara ürünlerin hüzünlü doğasını aydınlatmaya yardımcı olabilir.