Termal nosisepsiyon değerlendirilmesi Yerel ve Küresel Yöntemleri

Aşağıdaki deneyin genel amacı, drosophila larvalarında termal nosisepsiyonu analiz etmektir. Bu işlem, drosophila larvalarının toplandığı ve ardından isteğe bağlı ikinci bir adım olarak zararlı termal uyarılara maruz bırakıldığı yöntemle gerçekleştirilir. Larvalara, doku hasarına ve termal nosiseptif duyarlılaşmaya neden olan UV ışınlaması uygulanabilir. Sonrasında, nicel olarak ölçülebilen nosiseptif yanıtları tetiklemek amacıyla larva, bir ısı probu ile lokal olarak veya bir ısı plakası kullanılarak global olarak sorgulanabilir.

Isı probu, larvaların ısıya karşı verdikleri nosiseptif tepkinin bir üst sınırı olduğunu ve girdi sıcaklığı ile tetiklenen tepkinin genliği arasında şaşırtıcı bir ilişki bulunduğunu göstermektedir. Isı plakası deneyi, larvaların çevredeki suyun sıcaklığına ve nosiseptif duyusal nöronların aktivitesine bağlı olarak stereotipik bir nosiseptif davranış dizisi sergilediğini göstermektedir. Burada açıklanan yöntemler, hayvanların lokal veya global olarak sunulan zararlı termal stimuluslara farklı tepki verip vermedikleri gibi, termal nosisepsiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Genel olarak, ısı probu deneyiyle yeni tanışan bireyler; uygulanan probun basıncındaki, konumundaki ve iletim açısındaki varyasyonları minimize etmek için pratik gerektirdiğinden zorluk yaşayacaklardır. Isı plakası deneyinin görselle gösterilmesi kritik öneme sahiptir; çünkü artan sıcaklıkla ortaya çıkan davranışların en iyi şekilde anlaşılması için görülmesi gerekir. İlgilenilen tanımlı bir genotipten yeterli sayıda yavru larva elde etmek için, istenen stokları doğrudan büyütün veya yumurtlama gününden beş gün sonra, 20 ila 30 bakire dişi ve 15 ila 20 erkek kullanarak sinek besiyeri içeren şişelerde çaprazlamalar kurun; yumuşak sinek besiyerini kepçeyle çıkarıp 630 mikron gözenek boyutuna sahip bir elekten nazikçe akan suyla süzerek erken üçüncü instarda bulunan larvaları toplayın ve temizleyin; açlığı ve kurumayı önlemek için erken üçüncü instar larvaları küçük, nemli bir besiyeri pedine aktarın.

Bir anestezi odası oluşturduktan sonra, bir pens veya boya fırçası kullanarak 10 adet erken üçüncü instar larvayı nazikçe kapağın iç kısmına yerleştirin ve kapatın. Bir çeker ocak içinde, anestezi odasını, içinde 1,5 mililitre dietil eterle ıslatılmış bir pamuk topu taşıyan 10 mililitre kapasiteli bir beher bulunan bir bağlantı kavanozunun içine yerleştirin. Larvaları iki ila 2,5 dakika boyunca eter buharlarına maruz bırakmak için bağlantı kavanozunun kapağını vidalayarak kapatın.

Anestezinin ardından, anestezi odasını Coplan kavanozundan çıkarın ve kalıntı eter buharlarının dağılması için çeker ocak altında birkaç saniye bekletin. Larvaları anestezi odasından küçük bir Petri kabına nazikçe aktarmak için bir su püskürtme şişesi kullanın. Anestezize edilmiş larvaları kurutmak için tampon yapın ve ardından onları, üç inç çarpı bir inç boyutundaki cam mikroskop lamına sabitlenmiş çift taraflı şeffaf bant şeridine sırtları yukarı bakacak şekilde nazikçe yerleştirin.

Lamı bir UV ışınlama haznesinin alt yüzeyine yerleştirin ve larvaları 20 millijoules per centimeter squared yoğunluktaki UV ışığına altı saniye boyunca maruz bırakın. Işınlamadan sonra, larvaların çift taraflı yapışkan banttan nazikçe ayrılıp yüzeye çıkmalarını sağlamak için lamı suya daldırın. Işınlanmış larvaları 15 by 45 millimeter boyutundaki bir kaba nazikçe yerleştirmek için pens veya resim fırçası kullanın.

Yeniden konaklandırmadan önce, 25 °C veya istenen kültür sıcaklığında sekiz ila 24 saat boyunca dinlendirmek üzere bir mililitre sinek besini içeren bir dramlık cam kültür şişesi. Termal nosisepsiyon deneyleri için öncelikle termal probun sıcaklığını istenen ayar noktasına getirin. Bir adet larvayı nazikçe düz bir platforma aktarmak için bir resim fırçası veya pens kullanın ve larvanın ince bir su tabakasıyla kaplandığından emin olun.

Basınçtaki varyasyonu minimize etmek ve ısı probunun doğru konum ve açısını sağlamak için pratik yapmak önemlidir. Prob ucunu, prob ile larva yüzeyi arasında yaklaşık 45 derecelik bir açı oluşturacak şekilde, hafif bir basınçla larva A4 segmentine nazikçe bastırın. Uygulanan basınç, larva yüzeyinde hafif bir çöküntüye neden olmalı ve genellikle lokomosyonu engellemek için yeterli olacaktır.

Larvalar bir geri çekilme yanıtı sergileyene veya 22. kesinti noktasına ulaşana kadar stimülasyona devam edin. Yanıt veren larvalar tipik olarak önce baş ve kuyruğu kaldırma şeklinde öncül bir davranış gösterir, bunu en az 360 derece yuvarlanma şeklindeki geri çekilme davranışı takip eder. Geri çekilme davranışı başladığında, prob ile teması kesin ve geri çekilme süresini veya gecikme süresini kaydedin.

20 saniye içerisinde herhangi bir geri çekilme davranışı gözlemlenmezse, larva yanıt vermeyen (non-responder) olarak kabul edilir. Yeterli yüksek kontrastlı aydınlatma sağlandığından emin olmak için fiber optik ışık kılavuzlarını konumlandırın. Larvaları görüntülemek için, ısıtma bloğunu düz yüzeyi yukarı gelecek şekilde ısıtma tablasına yerleştirin ve ardından ısıtma tablasını mikroskop tabanının üzerine koyun.

Isıtıcı plakayı yüksek ayara getirin ve sıcaklığın 95 degrees Celsius derecede stabilize olması için yaklaşık 15 dakika bekleyin. Bir mikropipet kullanarak 80 µL distile su ölçün ve su damlasını 60 by 15 mm'lik polistiren bir Petri kabının ortasına yerleştirin. Temiz bir orta üçüncü dönem larvayı, mümkün olduğunca az ek su girişi sağlayarak, forseps yardımıyla nazikçe su damlasının ortasına yerleştirin.

Petri kabını ısıtıcı plaka üzerindeki katı ısıtma bloğuna nazikçe yerleştirin. Larvaların tamamı ve su damlası görünür olacak şekilde kabın konumunu hızlıca ayarlayın. Zamanlayıcıyı başlatın.

Şu anda Petri kabı, ısıtıcı plakanın katı ısıtma bloğunun üzerine yerleştirilir ve her bir davranışın başlangıç zamanı kaydedilir. Beş. Suya daldırılmış larvanın ısıtıcı plakaya aktarılması üzerine stereotipik lokomotor davranışlar gözlemlenir. Isının yokluğundaki normal davranış, arama amaçlı baş hareketlerinin eşlik ettiği şemsiye tipi lokomosyonu içerir.

Sıradaki aşamada, larvanın başını hızlı bir şekilde ileriye veya yanlara doğru hareket ettirdiği kafa sallama davranışı görülebilir. Bu hareket, sudaki normal lokomosyonlarına benzer own ancak daha sarsıntılı ve sürekli bir yuvarlanma şeklinde gerçekleşir. Davranış, larvalar yanlamasına en az tam 360 derece yuvarlandığında gerçekleşmiş sayılır.

Bu durum değişken sayıda gerçekleşebilir ve bazen tamamlanmamış yuvarlanmaları da içerir. Davranışın puanlanması amacıyla yalnızca tam 360 derecelik yuvarlanmaları sayın. Bu davranış, kırbaç davranışı sırasında ısı probunun lokal uygulamasıyla karşılaşılan sahneye en benzer olanıdır.

Larva, başın çok kısa bir süreliğine kuyruğa yaklaştığı, anteroposterior eksen boyunca hızlı kasılma-gevşeme hareketleri sergiler. Kamçılama hareketi genellikle hızlı bir ardışıklıkla veya yuvarlanma ile eş zamanlı olarak gözlemlenir. Son olarak larva, genellikle felci takip eden nöbet benzeri davranışlar sergiler. Nöbet davranışı sırasında larva, anteroposterior eksen boyunca uzanır ve tüm vücutla yüksek frekanslı titremeler sergiler.

Larvaların hareketinin durmasıyla birlikte, bükülme felci olmaksızın titreme davranışı görülür. Bazı larvalarda bu durum kalıcıyken, diğerleri daha sonra düşük frekanslı bir pulsasyon hareketi sergiler. Her bir kategoriye ait yanıt verenlerin yüzdesini gösteren bu grafikte, larval termal nosisepsiyon yanıtı için bir üst sınır bulunmaktadır. Isı probu deneyinde, 52 °C prob sıcaklığına kadar larvaların %100'ü hızlı yanıt verenlerdir.

Buna karşın, 54 °C ve üzerindeki sıcaklıklarda, larvaların %90'ı veya daha fazlası 20 saniyelik temas süresinden sonra bile yanıt vermemektedir. Bu larvalar 22. kesme noktasından sonra hareket etmeye devam etseler de, yuvarlanma sayısı veya kaçınma geri çekilme davranışı için harcanan süre de ölçülebilir ve grafiğe dökülebilir. Şaşırtıcı bir şekilde, prob giriş sıcaklığı ile yanıtın gücü arasında ters bir ilişki olduğu görülmektedir; zira daha düşük sıcaklıkların daha yüksek sayıda yuvarlanmayı tetiklediği görülmektedir.

Suya batırılmış larvanın ısıtma plakasına aktarılması üzerine beş stereotipik lokomotor davranış gözlemlenir. Bu davranışların gözlemlendiği ortalama gecikme süreleri ve burada sunulan optimal analiz koşulları altında her bir gecikme süresi için ölçülen ortalama su damlası sıcaklıkları burada gösterilmiştir; her bir belirgin davranışı sergileyen larvaların yüzdesi %77 ile %100 arasında değişmektedir, ancak zaman zaman yuvarlanma ve kamçılamı davranışları atlanabilir, üst üste binebilir veya ters sırada gerçekleşebilir; ısıtma plakası analizinde paralizi davranışının başlamasını takiben hayatta kalan larvaların yüzdesi burada gösterilmiştir. Larvalar paralizi gerçekleşene kadar ısıtılmış ve ardından toparlanmaları için standart kültür koşullarına geri alınmıştır.

Kontrol grubu larvalar, ısıya maruz kalma hariç eşdeğer işlem görmüş olup, canlı yetişkinlerde PPE oluşumu yedinci ve on üçüncü günler arasında kantitatif olarak belirlenmiştir. Burada, MD G four, dört multidendritik periferik duyusal nöron sınıfının tamamında UAS tarafından düzenlenen transgenlerin ekspresyonunu tetikler. UAS orrc 1 delta C, sinaptik iletim için gerekli olan drosophila açık doğrultucu potasyum kanalının modifiye edilmiş bir versiyonunu eksprese ederken, UAS orrc 1 delta NC ise aynı kanalın sinaptik iletime müdahale etmeyen daha fazla modifiye edilmiş bir versiyonunu eksprese eder.

Sadece hem MD GALF four sürücüsüne hem de UAS ORC one delta C transgenine sahip larvaların, gözlemlenen beş davranıştan dördünde artmış gecikme süreleri gösterdiğine dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, GEs offal larvalarının zararlı termal uyarılara karşı hem lokal hem de global yanıtlarının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürler, termal nosisepsiyon için gerekli genleri belirlemek amacıyla genetik analiz gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilir. Isı probu deneyini uygularken; varyasyonu, probun uyguladığı basıncı, konumunu ve temas açısını minimize etmeyi hatırlamak önemlidir.