Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

Bu prosedürün genel amacı, mikrosaniye zaman ölçeğinde biyokimyasal bir reaksiyonu başlatmak için iki çözeltiyi hızla karıştırmaktır. Bu işlem, öncelikle bir mikroakışkan karıştırıcı imal edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise kanalları mühürlemek için bir çipin bir örtü camına bağlanmasıdır.

Ardından, çip, solüsyon rezervuarlarını içeren bir manifolda monte edilir. Son adım, karıştırılmış solüsyonun konfokal floresan mikroskopi ile görüntülenmesidir. Nihayetinde, çıkış kanalı boyunca katedilen mesafe zamana dönüştürülerek biyokimyasal reaksiyon mikrosaniye ölçeğinde kaydedilir.

Bu tekniğin stop flow karıştırma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, karıştırmanın türbülans ile sınırlı olmaması ve birkaç mikrosaniye içinde gerçekleşmesidir. Bu yöntem, protein katlanması alanındaki "hidrofobik çökkünme ne zaman gerçekleşir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Ling Woo, mikroakışkan karıştırma çiplerinin imalatına başlayarak uygulamalı olarak gösterecektir.

Öncelikle dört inçlik FU silika gofretleri, bu videoya eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı şekilde taze piranha çözeltisi ile temizleyin. Ardından, nihai mikroakışkan kanalların hedeflenen her 10 mikron derinliği için yaklaşık bir mikron kalınlığında bir polisilikon kaplama uygulamak üzere düşük basınçlı kimyasal buhar biriktirme fırını kullanın. Gofretlerin metinde açıklanan ek işlemleri tamamlandıktan sonra, gofretlerin üzerine 900 nanometre kalınlığında bir Z 52 14 fotoresist tabakası spin kaplama yöntemiyle uygulayın; ardından doğrudan bir sıcak tabla üzerinde 90 °C'de bir dakika veya bir fırında 110 °C'de 30 dakika boyunca yumuşak pişirme (soft bake) işlemi gerçekleştirin.

Bir foto maske hizalandıktan sonra, önce fotoresisti birkaç saniye boyunca UV ışığına maruz bırakarak sert ve vakumlu bir temas sağlayın. Ardından, yazılı protokolde belirtildiği şekilde fotoresistteki deseni geliştirin. Gofret üzerindeki özellikleri bir mikroskopla inceleyin ve doğrudan bir sıcak plaka üzerinde iki dakika boyunca 115 degrees Celsius sıcaklıkta sert pişirme işlemi uygulayın.

Ardından, gofretleri Asher veya oksijen plazması ile 100 watt RF gücünde 2,5 dakika boyunca DCU işlemine tabi tutun. Derin reaktif iyon aşındırıcı kullanarak, poli silika tabakasını alttaki erimiş silikaya kadar tamamen aşındırın. Kalan fotoresist tabakasını temizleyin ve gofreti metinde belirtildiği şekilde işleyin.

Aşındırma derinliğini ölçerek poli kaplamanın tamamen geçildiğinden emin olun. Oksit aşındırma kapasitesine sahip derin reaktif iyon aşındırıcı kullanarak, poli kaplama kalınlığının her mikronu başına yaklaşık 10 mikron derinliğe kadar erimiş silikayı aşındırın. Wafer'ı matrix Asher ile dört dakika boyunca 100 watt RF gücünde temizleyin ve wafer üzerine delikler açmadan önce polisilikonu bir xenon diflorür aşındırıcı ile şeritlendirin; sonraki işlemler sırasında kanalları korumak için yeni bir mikron kalınlığında fotoresist tabakasını spin coat yöntemiyle kaplayın.

Ardından, gofretin özellik tarafı aşağı gelecek şekilde Aqua Bond 55 kullanılarak feda edilebilir bir cam plaka üzerine monte edin. Bağlayıcıyı kabarcıklardan uzak tutmaya özen göstererek, mikro 90 temizleme çözeltisi ile bilgisayar kontrollü elmas uçlu matkabı soğutun. Bu işlem, küçük cam parçalarının kanallara yapışmasını ve böylece kullanım sırasında çipin tıkanmasını önler.

Her bir çipte giriş ve çıkış deliklerini delme işlemine geçin. Her bir deliğe şırınga ile su enjekte ederek gofretle deiyonize su ile durulama yapın. Ardından, fotoresist tabakasının kaldırılmasının ardından bir saat boyunca sabunlu suda bekletin.

Metinde açıklandığı şekilde direnç ve bağlayıcı uygulayın. Gofreti deiyonize su ve ılık sabunlu su ile durulayın. Gofret üzerine azot akıttıktan sonra, aşındırılmış özelliklere dikkat ederek her bir deliği şırınga ile tekrar durulayın.

120 °C'ye ayarlanmış bir vakum fırınında kurutmaya devam edin. Deliklerin kum ve benzeri partiküllerden arındırılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin ve gerekirse temizleme adımlarını tekrarlayın. İzleyen adımlar temiz odada gerçekleştirilmelidir.

Kanalların derinliğini optik veya mekanik bir yüzey profilometresi ile ölçün. Gofreti ve füzyon silika kapak camını, temiz oda içerisinde metinde açıklandığı şekilde temizleyin. Gofreti azot gazı ile en az beş dakika boyunca iyice kurulayın.

Ardından, gofretin özellikli yüzeyi yukarı bakacak şekilde, küçük bir cam levha gibi sert ve düz bir yüzey üzerine yerleştirilmiş üç ila dört adet temiz oda mendilinden oluşan bir yığının üzerine koyun. Aynı işlemi lamel için de tekrarlayın. Lameli kenarından tutun ve cilalı yüzeyi gofretin üzerinde aşağı bakacak şekilde ters çevirin.

Düz kenarları dikkatlice hizalayın, lamine camı wafer üzerine bırakın ve yerleşmesine izin verin; hizalamayı ayarlamak için yalnızca yatay olarak hafifçe itiniz. Wafer'ın merkezine bir parmağınızla bastırın. Bir bağlanma hattının dışarıya doğru yayılmaya başladığı görülmelidir.

Gerekirse, bağlama cephesini ilerletmek için wafer'ın çevresindeki diğer konumlara ek basınç uygulayın. Mühürlenmiş wafer'lar, metinde belirtilen sıcaklık profili ile programlanmış yüksek sıcaklıklı bir fırına yerleştirildikten sonra, bir wafer kesme testeresi ile tekil çiplere bölün. Karıştırma çipini ve çözeltileri tutacak manifold; lexan veya pleksiglas gibi plastiklerden ya da alüminyumdan yapılabilir.

Sıcaklık kontrolü için, çipi manifolda küçük o-ringler yardımıyla sabitleyin ve çipin merkezinin net bir optik görünümüne izin veren bir tutucu halka ile yerinde tutun. O-ring kanalları, çipe çok fazla basınç uygulamadan iyi bir eşleşme sağlamak için standarttan daha sığ olmalıdır. Çip monte edildikten sonra, kuyucukların dibinde hapsolmuş hava kabarcıklarını salmaya dikkat ederek merkez ve yan rezervuarlara çözeltileri ekleyin.

Manifoldu ters bir mikroskoba yerleştirin ve karıştırma bölgesini oküler veya kamera çıkışı ile inceleyin. Manifoldun üzerine yerleştirilen akkor bir el feneri yeterli ışığı sağlayacaktır. Jeti görüntülemek için merkez kanalında bir boya veya yüksek kırılma indeksli bir çözelti kullanın.

Bu karıştırıcıda kullanılan hacimler çok küçük olduğundan, akış, çözelti kuyucuklarının üzerine uygulanan hava basıncıyla kontrol edilebilir. Jeti görselleştirmek için yan kanal basıncını sıfır psi değerinden başlatın ve merkez kanal ile eşit basınca ulaşana kadar yavaşça artırın. Yan kanallardan biri tıkalıysa, jet çıkış kanalının duvarlarından birine doğru itilecektir.

Görünür bir tıkanıklık oluşursa, bir şırınga ile çıkış kanalına basınç veya vakum uygulanarak giderilebilir. Eğer çip protein veya diğer organik maddeler nedeniyle tıkanırsa, gece boyunca piranha çözeltisi içinde bekleterek temizlenebilir. Mikroskobun içinde veya hemen dışında bulunan dikroik bir ayna kullanarak, kaplanmış bir lazer ışınını araştırma düzeyindeki bir mikroskoba yönlendirin.

Lazer odağının okülerde veya kamerada karıştırma bölgesine yakın bir yerde görülebileceği şekilde hizalamasını yapın. Karıştırıcıdaki proteinden gelen floresans, objektif tarafından toplanır, dikroik aynadan geçirilir, bir mercek tarafından odaklanarak iğne deliğine gönderilir ve bir foton sayacı üzerinde görüntülenir. Karıştırma bölgesini görüntülemek için x ve y eksenlerinde piezoelektrik bir tarayıcı kullanarak çipi tarayın.

Jet üzerinde bir konum seçin ve kanalın merkezindeki dikey odağı bulmak için X ve Y eksenlerinde tarama yapın. Mikroskobun alan derinliği, kanal derinliğinden çok daha azdır ve akış hızı, duvarların bir mikron yakınındaki alanlar hariç kanal boyunca tekdüzedir. Bu nedenle, gözlemlenen floresansın zamansal çözünürlüğü öncelikle konfokal noktanın boyutu tarafından belirlenir.

Jet boyunca, çıkış kanalı içerisinde 100 mikronluk artışlarla yatay tarama yaparak her pozisyonda yaklaşık bir milisaniye boyunca gözlemleyin. Daha sonraki zamanları yakalamak için mikroskop tablasını jet boyunca 80 ila 90 mikron hareket ettirin. Alternatif olarak, ışık, dikroik aynadan sonra bir lens kullanılarak giriş yarıklarına odaklanabilir ve bir spektrograf ile CCD tarafından tespit edilebilir.

Veri toplama işlemi foton sayaca kıyasla daha yavaş olduğundan, genellikle önce jet foton sayacıyla görüntülenir ve ardından jet boyunca belirli noktalar spektrograf ile ölçülür. Foton sayacından elde edilen veriler, her konumda jetin etrafındaki üç ila beş piksel toplanarak şiddete karşı mesafe grafiği oluşturulmasıyla analiz edilir. Zaman, uygulanan basınçlara dayalı olarak hesaplanan hız kullanılarak mesafeden hesaplanır.

Son adım olarak, spektrograftan gelen verileri metinde açıklanan yöntemlerden birini kullanarak analiz edin. Burada, foton sayacı tarafından ölçülen karıştırma bölgesindeki yoğunluğun bir kontur grafiği gösterilmektedir. Jetin dışındaki çıkış kanalındaki arka plan, detektörün gürültü tabanına yakın olmalıdır ve tipik olarak çıkarılmaz.

Daha yüksek bir arka plan, zayıf hizalamaya veya proteinin kanal duvarlarına yapıştığına işaret edebilir. Aksine, özellikle karıştırma bölgesi yakınında bükülmüş veya eğri görünen bir jet, nozulların yetersiz aşındırıldığını gösterir. Alexa 488 ve Alexa 647 ile işaretlenmiş protein ACell koenzim a bağlayıcı protein veya A CBP'den elde edilen zamana bağlı bir spektrum gösterilmektedir.

Yeşil ve kırmızı dikdörtgenler sırasıyla donör ve akseptör kanallar olarak belirlenen dalga boylarını göstermektedir. Bu veriler, karanlık yükü ve lazer sinyalini gidermek için arka plan çıkarma işlemine tabi tutulmuştur. Arka plan sinyali, merkez kanal basıncı sıfır pound per square inch olacak şekilde alınmıştır.

Karıştırma süresi, potasyum iyodür ile triptofan floresan sönümlemesi gibi karıştırmadan çok daha hızlı gerçekleşen hızlı bir reaksiyon ölçülerek belirlenebilir. Jet, mikroskobun optik çözünürlüğünden daha küçük olduğu için karıştırma bölgesinde büyük bir yoğunluk düşüşü meydana gelir. Jet oluşurken, hiçbir çözelti koşulunun değiştirilmediği bir kontrol ölçümü yapılarak bu cihaz yanıtı ortadan kaldırılabilir.

N-Asetil triptofan amid floresansının karıştırma ve karıştırmama deneylerinin oranı bu şekilde gösterilmektedir. Çizgi, konsol multiphysics modelleme ve simülasyonlarından elde edilen potasyum iyodür tahmini konsantrasyonunu göstermektedir. Konsantrasyonun %80 oranında azalması için geçen süre olarak ölçülen karıştırma süresi sekiz mikrosaniyedir.

Bu grafik, denatüre edici konsantrasyonunun altı molar değerden 0,06 molar değere seyreltilmesi sonrası protein A CBP'deki FRET değişimlerini göstermektedir. Bu veriler için bir kontrol deneyine gerek yoktur. FRET halihazırda bir oran olduğu ve cihaz yanıtı önceden çıkarıldığı için, T sıfıra yakın bölgedeki hızlı sıçrama, karıştırma süresi içinde FRET sinyalindeki hızlı bir değişimi temsil etmektedir.

Bu gelişmenin ardından, söz konusu teknik, protein katlanması alanındaki araştırmacıların protein yapısının oluşumundaki ilk aşamaları keşfetmelerinin yolunu açmıştır.