Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Aşağıdaki deneyin amacı, mevcut damarlardan yeni kan damarlarının oluşumu olarak tanımlanan anjiyogenezde yer alan mekansal ve zamansal hücresel dinamikleri belirlemektir. Basit ve tekrarlanabilir bir model kullanarak, önce sıçan mezenterini kısa süreliğine dışarı çıkararak anjiyogenezi uyarın ve stimülasyon sonrası farklı zaman noktalarında mezenterik dokuları toplayın. Ardından, doku kesitlerini immünolojik olarak işaretleyin.

Örneğin, bir doku içindeki tüm yeniden şekillenen damarlanmayı görüntülemek için bir endotel hücre belirteci kullanın ve büyüyen mikrovasküler ağların temel bir iki boyutlu görselleştirmesini oluşturun. Bu model, beraber alındığında nispeten kısa bir zaman seyri boyunca birden fazla anjiyojenik metrikte çarpıcı bir artış sağladığı için caziptir. Ağların tek hücre düzeyinde görüntülenmesi ve bu metriklerin çok hücreli etiketleme ile korelasyonu, kapiller filizlenmeyi içeren yeni hücre fenotiplerinin belirlenmesinde son derece yararlı olmuştur.

Bu yöntem, mikrovasküler ağ büyümesinde yer alan hücresel dinamiklere ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bunlar arasında, kılcal damar filizlenme sürecinde belirli hücrelerin ne zaman ve nerede mevcut olduğu yer almaktadır. Bu yöntemin temel avantajları; basit olması, minimum cerrahi müdahale gerektirmesi ve nispeten kısa bir süre içinde güçlü bir anjiyojenik yanıt oluşturmasıdır.

Ek olarak, tek hücre seviyesine kadar bozulmamış bir ağın gözlemlenmesine olanak tanıyan bir doku olan rap mezenterinden yararlanılmaktadır. Deneyimlerimize göre, prosedürün gösterilmesiyle birlikte öğrenilmesi oldukça kolaydır ve dolayısıyla araştırmacıdan araştırmacıya tekrarlanabilir niteliktedir. Bugün, laboratuvarımızda lisansüstü öğrencisi olan Peter Stapler, beraberindeki metinde ayrıntıları verildiği şekilde cerrahi işleme hazırlık yapacaktır.

Sıçanın karın bölgesini tıraş ettikten sonra, vücut sıcaklığını korumak için anestezi altındaki sıçanı sırt üstü bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin, karın bölgesini sırasıyla %70'lik izopropil alkol ve iyot emdirilmiş steril gazlı bezlerle temizleyin; sternumun yaklaşık bir inç altına cildi ve ardından linea alba boyunca küçük bir boylamsal insizyon yapın. Önceden kesilmiş örtüyü, açıklık insizyonla hizalanacak şekilde karın bölgesinin üzerine yerleştirin. İnce bağırsağı açığa çıkarmak için insizyonun etrafına nazikçe baskı uygulayın. Pamuklu aplikatörler yardımıyla, ince bağırsağın bir bölümünü nazikçe dışarı çıkarıp mezenterini steril salin içeren plastik platformun üzerine yerleştirin ve ileumu belirleyin.

İnce bağırsağı besleyen arter-ven çiftleri arasındaki ince, yarı saydam membran olan altı ila sekiz vaskülarize mezenterik pencereyi belirleyin. Dış ortam başlangıç saatini kaydedin ve 20 dakikaya bir zamanlayıcı kurun. Merkezi konumdaki iki mezenterik pencereyi, bağırsağa yakın yağlı bölgede steril yedi sıfır sütür ile işaretleyin.

Dokunun daldırılmış ve nemli kalmasını sağlamak için, steril beş mililitrelik bir şırınga kullanarak Petri kabındaki salini ara ara yenileyin. Eksternalizasyon süresi dolduktan sonra, mezenteri karın boşluğuna geri yerleştirin. Karın kasını, beş sıfır monofilaman sütür ile kopuk dikiş şeklinde kapatın.

Ardından cildi, kesikli dikiş modeliyle dört sıfır monofilaman sütür kullanarak kapatın; sütür bölgesini %70'lik izopropil alkol ve iyot emdirilmiş steril gazlı bezle sırasıyla silerek temizleyin, sıçanın her iki gözüne kayganlaştırıcı jel sürün ve iyileşmesi için kafesine geri koyun. İlgilenilen günde, stimülasyon sonrası, sıçanı kurum yönergelerine uygun olarak anestezi altına alın ve ötanize edin. Ardından karın boşluğunu tekrar açın ve karın bölgesini bir parça streç filmle örtün. Şimdi ince bağırsağı nazikçe dışarı çıkarın ve pens ile mikro makas kullanarak işaretlenmiş iki pencereyi bulun.

Yağ kenarını da içerecek şekilde, dışarı çıkarılan mezenterik pencerelerin her birini kesin. Pencerelerin potansiyel olarak kanla dolmasını en aza indirmek için, yağ kenarı içindeki arter-ven çiftlerini kesmekten kaçının. Ayrıca, bağırsak içeriğinin sızmasına neden olacak bağırsak kesimlerini minimize edin.

Pencerelere temas eder etmez, her bir pencereyi hemen PBS içine daldırın. Ardından, dokuları pozitif yüklü mikroskop lamlarına yaymak için pens kullanın. Her lama iki doku yerleştirin. Dokular kısmen kuruduktan sonra, fazla yağı bir bistüri ucuyla temizleyin.

Numuneleri dondurucuya yerleştirerek -20 °C'de 30 dakika boyunca metanol ile fikse edin. Fazla tampon çözeltiyi uzaklaştırmak için lamları vakumlu kurutmaya tabi tutun. Ayrıca, antikor çözeltilerinin dokudan kontrolsüz bir şekilde akmasını önlemek için dokuların etrafını balmumu kalem ile çerçeveleyin.

Şimdi, tüm dokuyu kaplayacak şekilde yaklaşık 200 µL seyreltilmiş primer antikor çözeltisini damlatın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin, dokuları PBS artı %0,1 sapin ile tamponu üç kez değiştirerek yıkayın. Ardından, strep adin peroksidaz sekonder antikor çözeltisini ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; üç yıkamadan sonra örnekleri 15 dakika boyunca vector nova red içerisinde inkübe edin.

Slaytları monte etmek için suyla durulayın. 10 kez %95 etanol içine batırın ve ardından ardışıkdehidratasyon adımlarını uygulayın. Slaytların kurumasına izin verin, dokuları ince bir tabaka tutkal ile kapatın; vakumlu kurutma ve işaretlemeden sonra lamelleri yerleştirin.

Lamlar. Doku örneklerini seyreltilmiş primer antikor çözeltisi ile kaplayın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Her yıkama 10 dakika sürecek şekilde, %0,1 saponin içeren PBS ile üç kez yıkayın. Ardından sekonder antikoru ekleyin ve bir saat boyunca inkübe edin. %0,1 saponin içeren PBS ile yıkama işlemlerini gerçekleştirin; lamları gliserol içeren PBS ile kapatın ve oje ile mühürleyin.

Burada, yaygın bir Petri kabının cerrahi platform olarak kullanılması için nasıl modifiye edildiğini detaylandırıyoruz. Mezenterin önceden kesilmiş delikten çekilebilmesi için pürüzsüz bir yüzey sağlamak amacıyla sarı modelleme kili kullanılmıştır. Eksternalizasyon süresi boyunca platformda gösterilen mezenterik pencereler, burada bağırsağı besleyen arter-ven çiftleri arasındaki ince, yarı saydam membranlar olarak tanımlanmaktadır.

PCAM etiketlemesi, eksternalizasyon sonrası belirli zaman noktalarında, yeniden şekillenen mikrovasküler ağların hiyerarşisi boyunca tüm damar tiplerini tanımlar. Bu görüntüler, stimülasyon sonrası belirli zaman noktalarında anjiyojenik metrikleri nicelleştirmek için kullanılabilir.

PCAM etiketlemesi, arteryollerin venüllerden ayırt edilmesini sağlar. Besleyici arteryollerin, eşleşmiş venüllere kıyasla tipik olarak daha küçük çaplar ve uzamış endotelyal hücre morfolojisi sergilediğine dikkat edin. Yeniden şekillenen ağların tipik özellikleri arasında vaskülarize alan, kapiller filizlenme ve damar yoğunluğu yer alır.

Bu çeşitli anjiyojenik metriklerin nicelleştirilmesi, ağ büyümesinin zaman seyrini karakterize eder. Mevcut damarlardan kılcal filizlenme üçüncü gün ile beşinci gün arasında zirveye ulaşır ve 10. güne kadar uyarılmamış seviyeye döner. Laboratuvarımızda, filizlenmedeki bu geçici artışı, vaskülarize alan ve vasküler yoğunluktaki artışlar takip etmektedir.

Bu model sistem, bu yeniden şekillenme sürecindeki belirli zaman noktalarında yeni hücresel fenotipik değişiklikleri belirlemek için kullanılmıştır. İmmünofloresan PCA markalaması endotel hücrelerini kırmızıya boyarken, sınıf üç beta tübülin markalaması sinirleri ve anjiyojenik damarlar boyunca yer alan parazitleri yeşile boyar. İlginç bir şekilde, uyarılmamış dokularda sınıf üç beta tübülin ekspresyonu sinire özgüdür.

Buna karşılık, kapiler filizlenmenin zirvesinde, perivasküler hücreler tarafından sınıf üç beta tübülin eksprese edilir. Bu tür bir sonuç, anjiyojenik süreçte yer alan yeni hücre tiplerini belirlemek için bu basit ve sağlam anjiyojenik modelin kullanımını vurgulamaktadır. 10. güne gelindiğinde, sınıf üç beta tübülin ekspresyon paterni uyarılmamış senaryoya dönmeye başlar.

Bu model aynı zamanda potansiyel olarak hücre soyu çalışmalarında da kullanılabilir. Önceden işaretlenmiş kemik iliği hücrelerinin veya mezenkimal kök hücrelerin, 20 dakikalık dışlama süresi boyunca mezenterik pencereler üzerine süperfüze edildiği bu ön çalışmalar, hücrelerin yeniden şekillenen mezenterik dokuya dahil edilmesinin fizibilitesini desteklemektedir. Bu videoyu izledikten sonra, mikrovasküler ağ büyümesinde yer alan hücresel dinamikleri araştırmak için sıçan mezenter interiorizasyon modelimizi nasıl kullanacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu basit teknik yaklaşık 45 dakika ile bir saat arasında gerçekleştirilebilir. Cerrahi bir işlemden sonra mezanterin hassas bir şekilde tutulmasının ve damarların delinmemesinin kritik olduğunu unutmayın. Kan damarları boyunca birden fazla hücre tipini tanımlamak için immün etiketleme yapılabilir.

Ayrıca lenfatik damarlar ve sinirler için de markalama yapabilirsiniz. Bu, sadece anjiyogenezde yer alan hücresel fenotipik değişiklikleri değil, aynı zamanda anjiyogenez, nörogenez ve lenfanjiyogenez arasındaki koordinasyonu incelememize olanak tanır.