Montaj ve 'Kayma Rings' Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli

Bu modelin genel amacı, endotel hücreler üzerinde In Vitro periyodik sıvı akışı ve kayma gerilmesi çalışmaları için basit ve ekonomik bir yöntem oluşturmaktır. Bu yöntem, Endotel Hücre Fizyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, periyodik kaymanın endotel hücre şekli, yapısı ve işlevi üzerindeki etkileri gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, hücresel yanıtların değerlendirilmesi için nispeten geniş yüzey alanları sağlayan, basitçe monte edilmiş bir doku kültürü düzeneği kullanmasıdır. Bu prosedürü, laboratuvarımdaki tıp öğrencisi Bay Luke White gerçekleştirecektir. Bu prosedüre, sunum yazılımı kullanarak 150 mm dış kenar profiline ve 150 mm'lik dairenin merkezine yerleştirilmiş 100 mm iç çapa sahip bir makaslama halkası yapım şablonu oluşturarak başlayın.

Şablonu bir sayfa A4 beyaz kağıda yazdırın. Yeterli havalandırmaya sahip bir çeker ocak altında çalışarak ve eldiven giyerek, 150 mm'lik bir cam Petri kabına 10 mm metilen klorür pipetleyin. Metilen klorür çoğu plastiği çözdüğü için kabın cam olması kritiktir.

150 mm'lik plastik bir Petri kabını dış kesme şablonu üzerine hizalayın. 100 mm'lik bir kabın merkezine 3 mm'lik bir delik açmak için döner alet kullanın. Delme işlemi sonucu oluşan tüm plastik talaşlarını temizleyin.

Eldivenli bir elle 100 milimetrelik Petri kabını tutarken, kabın üst kenarını ters çevirip yaklaşık üç saniye boyunca metilen klorür havuzuna daldırın. Fazla metilen klorürün 100 milimetrelik kaptan süzülmesini bekleyin ve ardından ıslatılmış kap kenarını hızla 150 milimetrelik kabın merkezine doğru indirin. 100 milimetrelik kabı işaretlenmiş şablona dikkatlice hizalayın.

150 milimetrelik kaba iyi yapıştığından emin olmak için 100 milimetrelik kabı saat yönünde ve saat yönünün tersine birkaç kez nazikçe döndürün. Metilen klorür kuruduğunda, yeni bağlanmış Petri kaplarını ters çevirin ve temas noktalarını dikkatlice inceleyin. Sıkı bir sızdırmazlık tamamen oluşmamışsa, transfer pipeti ile 3 milimetrelik delikten 0,5 mililitre metilen klorür enjekte edin.

Kabı kaldırın ve metilen klorürün kenara ulaşmasını sağlamak için nazikçe döndürün. İki Petri kabı arasında sıkı bir sızdırmazlık oluştuğundan emin olduktan sonra, 100 milimetrelik kaptaki deliği 3 milimetrelik bir silikon kauçuk sızdırmazlık malzemesi uygulayarak kapatın. Düz bir kesme başlığı takılmış döner bir alet kullanarak, 15 milimetrelik konikol polistiren doku kültürü tüpünün üstten 3 santimetrelik kısmını kesin ve kapağın altında tüpten en az bir santimetre bırakın.

Kesilen tüpün kenarını pürüzsüz ve düz hale gelene kadar parlatmak için kesme başlığının düz tarafını kullanın. Taşlama sonucu oluşan plastik talaşlarını temizleyin. Bir marker kullanarak, kesilmiş 15 milliliter konik tüpün izini, 150 millimeter çapındaki kabın kapağına, kabın kenarından yaklaşık 0.5 santimetre uzaklıkta olacak şekilde çizin.

Çizilen dairenin içine, dairenin kenarından yaklaşık bir ila iki milimetre pay bırakacak şekilde bir delik açın. Kesilmiş konik tüp üst kısmını açılan deliğin üzerine yerleştirin. Konik tüpü 150 milimetrelik kapağa sabitlemek için, bir transfer pipeti kullanarak konik tüpün kesik kenarlarına yaklaşık çeyrek mililitre veya 250 µL metilen klorür uygulayın.

Son olarak, üst Petri kabının iç kenarına 1 mm kalınlığında bir silikon kauçuk sızdırmazlık malzemesi şeridi uygulayarak 150 mm'lik kapağı 150 mm'lik kaba sabitleyin. Montajı tamamlanmış bir sızdırmazlık halkasının şeması gösterilmiştir. Mavi renk, ekilmiş endotel hücrelerin olduğu alanı temsil etmektedir.

Dış ve iç kırmızı oklar, orbital çalkalayıcıya yerleştirildiğinde makaslama halkasının ve makaslama halkasının içindeki ortamın orbital hareketini göstermektedir. Yeni oluşturulan makaslama halkasına, 15 mililitrelik konik tüp portu aracılığıyla yaklaşık 10 mililitre PBS pipetleyerek sterilizasyon için hazırlık yapın. Makaslama halkasının içindeki kalıntıları temizlemek için dairesel hareketlerle çalkalayın.

PBS'yi bir Pasteur pipeti ve vakumlu aspiratör ile uzaklaştırın. Tüm kalıntılar temizlenene kadar PBS yıkamasını tekrarlayın. Kesme halkasını sterilize etmek için %70 etanol durulama ve UV ışınlaması kombinasyonu kullanılacaktır.

Havalandırmalı kapağı çevirerek açın, erişim portu aracılığıyla yaklaşık 10 milliliters %70 ethanol pipetleyin ve kapağı tekrar kapatın. Sear halkasının içinin iyice yıkandığından emin olacak şekilde halkayı birkaç kez döndürün ve ters çevirin. Bir doku kültürü kabininde, fazla %70 ethanol'ü aspire edin.

Bir sprey şişesi kullanarak, erişim portunu ve kapağı %70 ethanol ile iyice püskürtün. Ardından, kesme halkasını ve kapağı tamamen kuruyana kadar doku kültürü davlumbazında UV radyasyonu altına yerleştirin. Kesme halkası kuruduğunda kapağı tekrar vidalayın.

Sterilize edilmiş kayma halkalarını, hücre kültürü ekiminde kullanılana kadar oda sıcaklığında saklayın. Bir kayma gerilmesi çalışmasına hazırlanmak için, önce standart hücre kültürü protokolünü izleyerek endotel hücrelerini sterilize edilmiş kayma halkalarına ekin. Akış çalışmaları başlatılmadan önce kültürün konfluense ulaşmasını bekleyin.

Hücreler konfluensa ulaştığında, raf stresini ve titreşimi en aza indirmek için inkübatörün alt rafına yerleştirilmiş bir orbital çalkalayıcı üzerine deney shear ringlerini yerleştirin. Statik kontrol grubu shear ringlerini aynı inkübatörün içine yerleştirin. Shear ringlerini, istenen shear stress uygulama süresi boyunca çalkalayıcıda bırakın.

Hücre katmanları istenen süre boyunca kayma kuvvetine maruz bırakıldıktan sonra, kayma halkalarını inkübatörden çıkarın. Kayma halkası kapağını çekerek açın ve istenen uç nokta analizi için hücreleri ve/veya medyumu geri alın. Kayma halkaları açıldıktan sonra, araştırmacıların analiz için çeşitli yöntemler kullanarak hücreleri ve medyumu hasat edebileceklerini unutmayın.

Şekilde, 48 saatlik periyodik sıvı kayma kuvvetine veya statik maruziyete tabi tutulan shear ring içindeki insan CMEC D3 Beyin Endotel hücresi monokatmanlarının görünümüne ait temsili sonuçlar gösterilmektedir; kültür hizalanmasının, oklarla belirtilen akış yönüne her zaman paralel olmadığı gözlemlenmiştir. Periyodik kayma kuvvetine verilen bazı yanıtlar Rat Retinal Mikro-vasküler Endotel hücresi monokatmanlarında gösterilmiştir. Shear ring'lerde uygulanan 72 saatlik periyodik sıvı kayma kuvveti, Beta-aktin yükleme kontrolüne oranla Platelet-endotelyal hücre yapışma molekülünde belirgin bir azalma ile sonuçlanmıştır.

Yöntem kavrandıktan sonra, düzgün bir şekilde uygulandığında yaklaşık üç saatte birkaç Shear Ring oluşturulabilir. Bu prosedürü uygularken, iç kabın dış kapla dikkatlice hizalanmasını ve aralarında sızdırmaz bir mühür oluşmasını hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, endotel hücreler üzerinde In Vitro periyodik sıvı akışı ve kayma gerilimi çalışmalarını gerçekleştirmek için basit bir yöntem olan shear ring'lerin nasıl oluşturulacağı ve kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Metilen klorür ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bunu gerektiren adımları uygularken çeker ocak altında çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.