Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Bu video makalesinde, oligosakkaritlerin otomatik çözelti fazı sentezi ve poli anhy nanopartiküllerinin fonksiyonelleştirilmesi için yeni bir hidro put protokolü açıklıyoruz. Bu karbonhidrat tabanlı hedefleme ajanları ile ilk olarak, katı faz sentezleyiciler yerine çözelti fazı sentezi kullanan otomatik bir sistem kullanılarak karbonhidrat molekülleri sentezlenir. Ardından, oligosakkarit ara ürünleri florist, katı faz ekstraksiyonu veya FSPE ile saflaştırılır.

Üretilen karbonhidrat molekülleri NMR ile karakterize edilir ve ardından karbo IDE konjugasyonu ile polianhidrit nanopartiküllere bağlanır. Son olarak, karbonhidrat ile fonksiyonelleştirilmiş nanopartiküller, X-ışını fotoelektron spektroskopisi ve bir hidro put fenil sülfürik asit analizi ile karakterize edilir. Nihayetinde, burada açıklanan hidro put metodolojisi kullanılarak, nanopartikül morfolojisini ve partikül yüzeyindeki karbonhidrat yoğunluğunu optimize edecek reaksiyon koşulları elde edilmiştir.

Bu yöntemin, katı faz oligosakkarit sentezi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yapı taşlarının çok daha düşük miktarlarda kullanılmasıdır. Bu yöntemde, genellikle 10 ila 20 eşdeğer yerine iki ila üç eşdeğer kullanırız. Bu yönteme dair fikri ilk kez, karşıdentritik hücrelerdeki reseptörleri hedeflemek için karbonhidratlar kullanarak polihidro nanopartiküllerin fonksiyonelleştirilmesi ile yüzey etkilerinin etkinliğini kanıtladığımızda geliştirdik. Daha sonra, bu yeni taşıyıcıların üretimi ve uygulamasında yer alan çok sayıda parametreyi taramamıza olanak tanıyacak yüksek kapasiteli bir sistem tasarlamak istedik.

Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir çünkü oligosakkaritlerin yüksek verimli sentezi ve bunların polimer parçacıklara bağlanması için otomatik platformların geliştirilmesi, mevcut dokümantasyonun az olduğu yeni bir araştırma alanıdır. Diano asidin otomatik sentezinden önce; tipik olarak trikloroasetamid olan uygun şekilde korunan bir şeker donörü ve temel olarak Alcon, florlu alkol olan bir akseptör tezgah üstünde sentezlenir ve klorometan içinde hazırlanır; ayrıca klorometan, %80 metanol ve %100 metanol içinde trimetil silo, triflorometan sülfonat da hazırlayın. Otomasyon odasındaki bağıl nemin %30 veya daha düşük olduğundan emin olun.

Yüksek nem, glikozilasyon reaksiyonları için zararlıdır. Aşağıdaki adımlar bir otomasyon platformu kullanılarak gerçekleştirilir. İlk glikozilasyon, donör ve florist alkolü ile gerçekleştirilir.

İşlem tamamlandığında, elde edilen florist tag şeker molekülü FSPE ile saflaştırılır. Ardından, geçici koruyucu grup sodyum, metoksit ve metanol kullanılarak uzaklaştırılır ve ürün tekrar FSPE ile saflaştırılır. Bunun ardından, florist tag şeker bir akseptör olarak kullanılır ve disakkaridi elde etmek için aynı donör ile kenetlenir; başlangıca geçmek için disakkarit FSPE ile saflaştırılır.

Donör akseptör promotörü, %80 metanol su, %100 metanol ve sodyum metoksit dahil olmak üzere reaktifleri robotik platforma yerleştirin ve programı başlatın. Robotik kol, önce donörü ardından akseptörü flakonlardan çekecek ve bunları bir reaksiyon flakonuna aktaracaktır. Ardından, donör ve akseptör karışımı 30 dakika boyunca karıştırılır.

30 dakika geçtikten sonra, robotik kol katalitik trimetil silil triflorometansülfonatı karışımın içine aktarır. Çözelti daha sonra 30 dakika daha karıştırılır. Karıştırma işlemi tamamlandığında program duraklar.

Reaksiyonun tamamlanıp tamamlanmadığını incelemek için ince tabaka kromatografisi ile kontrol etmek üzere 10 µL'lik bir alikot alın. Reaksiyon tamamlanmışsa, akseptör molekül görülmeyecektir. Reaksiyon tamamlanmamışsa, TLC plakasındaki akseptör hâlâ görünür durumdadır.

Eğer durum böyleyse, programı durdurun, glikozilasyon zamanlamasını yaklaşık 30 dakikaya sıfırlayın ve fazla miktarda promotör trimetil silo, tri fluoro, metan sülfonat ekleyin. Reaksiyon tamamlandığında bir sonraki adımla devam edin. Reaksiyon tamamlandıktan sonra robot, reaksiyon karışımını saflaştırma için C dokuz F 17 modifiyeli silika jel içeren FSPE kartuşlarına aktarır.

Ardından, kartuşlar sekiz mililitre %80 metanol ve ardından sekiz mililitre %100 metanol ile yıkanır. Floristleştirilmemiş fraksiyonu elemek için, istenen floristleştirilmiş ürün elde edilene kadar akış vials içerisine toplanır. Ek saflaştırma gerekirse, robotu durdurun ve uygun reaksiyon ürünlerini çıkarın.

Yapıya bağlı olarak, donörler son derece reaktif olmayabilir ve yeterli promotör eklendikten sonra bile bazı florist akseptör moleküller kalabilir. Bu durumda, FSPE saflaştırma için yeterince verimli olmayacaktır ve saflaştırmadan sonra silika jel kolon kromatografisi ile ek saflaştırma işlemi gerçekleştirilebilir; robotik kol reaksiyon tüpüne sodyum metoksit dağıtır. Reaksiyon daha sonra robotik platformda iki saat boyunca karıştırılır; TLC ile belirlendiğinde reaksiyon tamamlanmamışsa, inkübasyon süresini yaklaşık bir saat daha uzatın.

Reaksiyon tamamlandıktan sonra, ürün daha önce olduğu gibi FSPE ile saflaştırılır. Ardından, reaksiyon ürünü robottan çıkarılır ve laboratuvar tezgahında susuz toluende çözündürülür, ardından kalıntı suyu gidermek için evaporasyona tabi tutulur. Numune kuruduktan sonra, FSPE ile glikozilasyon saflaştırmasını da içeren aynı döngü için tekrar robota yerleştirilir.

Hedef molekül için istenen zincir uzunluğu elde edilene kadar, geçici koruyucu grubun derin korumasının ardından glikozilasyon işlemi tekrarlanır; otomasyondan elde edilen korunmuş ürünün korumasını kaldırmak için şişeyi robottan çıkarın. Prosedürün son adımlarında patlayıcı hidrojen gazı kullanılır ve bu adımlar otomasyon platformu dışında gerçekleştirilmelidir. Tezgah üzerinde, florist etiketindeki çift bağın ozonolizi gerçekleşir ve bunu, üretilen aldehitten karboksilik asite oksidasyon izler.

Elde edilen ürünü, laboratuvar tezgahı üzerinde diklorometan içinde %30 metanol karışımı kullanarak silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırın. Son olarak, benzo eter gruplarını paladyum katalizli hidrojenasyonla korumasız hale getirmek için, paladyumu uzaklaştırmak ve saf nihai ürünü elde etmek amacıyla ürünü bir satelit pedden geçirin. Ürünü nükleer manyetik rezonans veya NMR spektroskopisi kullanarak tamamen karakterize edin.

Yüksek kapasiteli polimer sentezi ve nanoparçacık üretimi, Peterson ve ark. tarafından açıklanan protokol takip edilerek gerçekleştirilir. Ekli belgede referans verildiği üzere, parçacık fonksiyonelleştirme için kullanılan otomatik biriktirme düzeneği; üç adet ne 1000 pompa, biri X yönündeki hareket için diğeri Y yönündeki hareket için olmak üzere iki aktüatörle entegre edilmiş bir robotik platform ve pompaların her bir yönü için birer adet olmak üzere toplam üç aktüatör içeren iki bitişik rafı olan ikinci bir robotik platformdan oluşmaktadır. Toplam beş aktüatör seri olarak bağlanmıştır. Aktüatörler ve pompalar, LabVIEW yazılımı kullanan bir bilgisayar tarafından çalıştırılır.

Parçacık üretimi için kullanılan kopolimer sistemleri, SEBA asidi veya SA ile altı bis, paraik karboksiy, oksil hekan veya CPH ve on sekiz BIS para karboksiy fenoksi üç altı dioksan veya CP Teeg'e dayanmaktadır. Nanoparçacık üretimi sonrası, polianhidrit parçacıkların yüzeyine karbonhidratların bağlanması için nanoparçacık kütüphanesini içeren 1,7 mililitrelik santrifüj tüplerinin bulunduğu bir raf, lineer aktüatör platformuna yerleştirilir ve iki ardışık reaksiyondan oluşan bir ortalama karboksilik asit kenetlenme reaksiyonu gerçekleştirilir; ilk reaksiyon için, programlanabilir bir şırınga pompasındaki şırınga, sırasıyla nanoparçacık başına iki miligram ve nanoparçacık başına 0,6 miligram konsantrasyonundaki EDC ve etilen diaminden oluşan sulu bir çözelti ile doldurulur.

Programlanabilir bir şırınga pompasındaki ikinci bir şırıngayı, nanoparçacık örneği başına toplam 12 eşdeğer olacak şekilde, 2,5 mg/mg parçacık oranında NHSA sulu çözeltisi ile doldurun. Ardından, LabVIEW programını kullanarak robotun reaktif süspansiyonlarını nanoparçacık kütüphanesine yerleştirmesini sağlayın. Robot aktüatörleri, çözeltilerin, EDC ve NHS'nin dağıtımı için tüp tutucuyu platformdaki doğru konuma taşıyacaktır.

Polianhidrit nanoparçacıkların yüzeyindeki karboksilik asit gruplarını aktive edin ve ortalama bir kenetlenmeye izin verin. Ardından, her tüpün içine bir sonikasyon probu daldırın ve her örneği 40 hertz frekansta 30 saniye boyunca sonikasyon işlemine tabi tutun. Bir sonraki örneğe geçmeden önce probu asetonla temizleyin.

Tüm numuneler doyurulduğunda, tüp tutucu robotik platformdan ayrılır. Nanoparçacık süspansiyonlarını dört °C'de sabit rotasyonla dokuz saat boyunca inkübe edin. Nihai sakkarit konsantrasyonunu ayarlamak için birinci ve ikinci reaksiyonların reaksiyon süreleri değiştirilebilir.

Reaksiyon tamamlandıktan sonra, tüpleri 12,000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Soğuk bir ortamda robotik istasyona geri dönün. Tüp tutucuyu robotik kola yeniden takın ve robotik platformdaki ikinci şırıngayı doldurun.

Soğuk su kullanıldığında, ilk şırınga boş kalmalıdır. Robotu başlatın. Her tüpteki süpernatan boş şırıngaya çekilir ve ikinci pompa tüplere soğuk su ekler.

Bu adım, nanoparçacık süspansiyonlarından reaksiyona girmemiş reaktifleri uzaklaştırmak için gerçekleştirilir. Ardından, daha önce gösterildiği gibi sonikasyon yoluyla nanoparçacık süspansiyonunu homojenize edin. Son olarak tüpleri 12,000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

İkinci reaksiyon yüklemesi için robotik düzenek kullanarak soğuk su ile ikinci bir yıkama gerçekleştirin; birinci pompaya nanopartikül örneği başına 12 eşdeğer EDC ve ikinci pompaya nanopartikül örneği başına 12 eşdeğer NHS ekleyin. Nanopartikül içeren tüplere uygun hacimlerin dağıtılması için robotik platformu başlatın. EDC ve NHS varlığı, nanopartikül yüzeyine halihazırda bağlanmış olan etilen ditin amin grupları ile korumalı şekerin karboksilik asit grubu arasında bir amit bağının oluşmasını sağlayacaktır.

Biriktirme işlemi tamamlandığında, 10 eşdeğer miktarda belirli bir sakkarit yükleyin. Bu çalışmada laktoz ve mevcut iki pompadaki glikolik asit kontrolü kullanılmıştır. Her bir sakkarit, her tüpte elde edilmek istenen fonksiyonelleştirmeye bağlı olarak test tüplerine biriktirilir; bu işlem, kullanılan spesifik reaksiyon için aktüatörleri ve pompa fonksiyonlarını çalıştırmak amacıyla kullanılan LabVIEW programında önceden programlanmıştır. Bu çalışmada karbonhidratların bağlanması için glikolik asit bir bağlayıcı kontrol olarak kullanılır; çünkü derin korumalı sakkaritler bu moleküle halihazırda kovalent olarak bağlıdır ve bu durum, nanoparçacık yüzeyine daha sonra bağlanmaya olanak tanır.

Nanopartikül süspansiyonları, daha önce yapıldığı gibi sonikasyonla homojenize edilir ve ardından dört degrees Celsius'ta sabit rotasyonla dokuz saat boyunca inkübe edilir. İnkübasyonun ardından, nanopartikül süspansiyonları santrifüj edilip süpernatant uzaklaştırılarak yıkanır, ardından pellet soğuk su içerisinde yeniden süspanse edilerek sonikasyona tabi tutulur; fonksiyonelleştirilmiş nanopartikül kütüphanesini içeren tüpler, kuruması için en az iki saat boyunca bir vakum odasına yerleştirilir. Fonksiyonelleştirilmiş nanopartiküller; yüzey kompozisyonu, konsantrasyon, partikül boyutu, boyut dağılımı ve yüzey yükünü değerlendirmek amacıyla dinamik ışık saçılımı ve diğer yöntemlerle karakterize edilir.

Burada gösterilen tam korumalı diano yan ürünü, otomasyon platformu kullanılarak sentezlenmiştir. Sentezlenen bileşiğin karakterizasyonu, VXR 400 megahertz spektrometre ile proton NMR kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Çözücü olarak CDC 13 kullanılarak, ürünün oluşumu bazı karakteristik piklerin varlığından teyit edilebilir.

Proton NMR diyagramında, 1.79 ile 2.21 arasındaki dört proton ve 3.38'deki iki proton floristin etiketine aittir. 2.16'daki singlet pik asetata karşılık gelirken, 4.94 ve 5.11'deki pikler, reaksiyon süresinin nanoparçacıkların nihai morfolojisi ve elde edilen şeker bağlanma derecesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için anomerik protonlardır. Nanoparçacıklar burada gösterildiği gibi artan reaksiyon süreleriyle fonksiyonelleştirilmiştir; 50 50 CPT CPH nanoparçacıklarının yüzeyindeki diano konsantrasyonu toplam reaksiyon süresiyle birlikte artmış ve 18 saat sonra maksimuma ulaşmıştır.

Toplam 24 saatlik reaksiyon süresiyle fonksiyonelleştirilmiş nanopartiküller, burada gösterildiği üzere, akış sitometrisi kullanılarak fare kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerdeki CLR'leri hedefleme yeteneklerini değerlendirmek için kullanılmıştır. Fonksiyonelleştirilmemiş nanopartiküllerin yanı sıra laktoz ve dano ile fonksiyonelleştirilmiş nanopartiküllerle yapılan stimülasyon sonrası, C tipi lektin reseptörlerine karşı DC-SIGN ve manoz reseptörünün ekspresyonunda artış gözlemlenmiştir. Bu durum, etkili bir hedeflemeye işaret etmektedir.

Buna karşın, Diano fonksiyonelleştirilmiş partiküller daha yüksek bir ekspresyon seviyesi göstermiş olup, bu durum söz konusu ligandın incelenen reseptörlere karşı özgüllüğünü ortaya koymuştur. Bu videoyu izledikten sonra, oligosakkaritlerin yüksek verimli otomatik sentezinin yanı sıra poli nanopartiküllerin fonksiyonelleştirilmesinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmanız gerekir. Hedefleme ajanları olarak bu karbonhidrat bazlı maddeler kullanıldığında, donör-akseptör korumalı şeker sentezi ve cihazın kurulumu ustalaşıldıktan sonra 24 ila 48 saat içinde tamamlanabilir.

Elbette, süre uzunluğu, fonksiyonelleştirme süresinin yanı sıra kütüphanenin boyutuna da bağlıdır. Bu yöntemi uygularken, biyobozunur poli hidro partiküllerin fonksiyonelleştirilmesine yönelik reaksiyon koşullarını, nanopartikül kimyasına bağlı olarak optimize edebileceğinizi unutmamak önemlidir. Bu prosedür takip edilerek, immünolojik sonucu etkilemek amacıyla farklı hücre reseptörlerini hedeflemek için çeşitli karbonhidrat yapıları sentezlenebilir.