Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

Küçük piko-litre boyutundaki damlacıklar içine kapsüllenmiş hücrelerin kullanıldığı uygulamalar, genellikle damlacık başına düşen hücre sayısının kontrol edilememesi nedeniyle kısıtlanmıştır. Bu protokol, akışkanlar dinamiğiyle hücre düzenleme ve akış odaklama mikro nozülünde damlacık üretimi şeklinde iki farklı mikroakışkan olguyu birleştirerek hücre kapsülasyonunu kontrol etme yöntemini göstermektedir. Bir üst akış kanalında, hücre veya partiküller içeren sulu çözeltinin yeterince yüksek bir akış hızıyla sağlanmasıyla, akış yönünde eşit aralıklı diziler oluşması sağlanır.

Sürfaktan ile stabilize edilmiş kabul edilebilir bir yağ taşıyıcı akışkan içerisinde, kilohertz hızlarda sulu damlacıklar oluşturmak için bir akış odaklamalı damla üretim nozulu kullanılır. Ardından, hücrelerin veya parçacıkların damla üretim nozuluna boylamsal olarak sıralı varışlarıyla senkronize damla üretim hızleri sağlamak amacıyla sulu ve yağ akış hızleri ayarlanarak, sıralı hücre parçacık dizileri damla üretimiyle birleştirilir; bu süreçte parçacıklar hücre vekilleri olarak kullanılır. Bu protokolü göstermek için akış hızleri, akışkanı sınırlayacak kadar küçük olmalıdır.

Biyolojik hücreler üzerindeki kayma gerilmeleri, hücre düzenleme damlacık üretiminin çakışması ve hücre canlılığı. Sulu akış hızı kısıtlamaları, tekil ve çoklu hücrelerin kontrollü enkapsülasyonu için ideal bir operasyonel rejim sağlar. Video mikroskopi verilerinin analizi, hem tekli hem de çiftli hücre veya partikül enkapsülasyon verimliliklerinin, rastgele enkapsülasyon verimliliklerinden daha yüksek olduğunu ve istenen sayıda hücre veya partikül içermeyen damlacık sayısını önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.

Hücrelerin ve damlaların hapsedilmesi, hücre salgılarının seyreltilmesini sınırlar, hücre heterojenliğini belirginleştirir ve dökme süspansiyona kıyasla hücreler arası sinyalleri kontrol eder. Bu hücrelerin damlacıklar içine kapsüllenmesi için kullanılan etkili yöntemler, biyolojik araştırmacılar için değerli bir araç sağlar. Bu prosedüre başlamak için, AutoCAD yazılımında bu şekilde gösterilen bir mikrokanal deseni tasarlayın.

Uzun kanal bölümü, 27 mikron genişliğindeki sulu akış düzenleme kanalını temsil etmektedir. Büyütülmüş nozul şeması, sulu düzenleme kanalı ve yağ kanalı için 27 mikronluk eşit kanal genişliklerini, ardından 22 mikronluk nozul daralmasını ve daha geniş olan 61 mikronluk bir kanala ani genişlemeyi göstermektedir. Cihaz yüksekliği 52 mikrondur.

Yağ girişinin bu büyütülmüş şemasında gösterildiği gibi, hem sulu hem de yağ girişlerinde, siparişleme kanal genişliğiyle aynı mertebede boşluklara sahip büyük kalıntı filtreleri bulunur. Burada, boya ile enjekte edilmiş siparişleme kanalının ve nozulun gerçek bir görüntüsü yer almaktadır. Kanalların koyu bir arka plan üzerinde şeffaf olduğu yüksek çözünürlüklü bir şeffaf maskeyi Mylar film veya kuvars üzerine yazdırmak için üçüncü taraf bir üretici ile çalışın.

Ardından, replika kalıplama için bir silikon ve SU-8 fotoresist master oluşturun. PDMS replika kalıplama işlemi için master kalıbı bir Petri kabının tabanına bantlayın. Replika kalıplama tamamlanıp cihaz hattı kesildikten sonra, bu şekildeki üç yuvarlak bölgeye akışkan portları açmak için 0,75 milimetre dış çaplı bir biyopsi punch'ı kullanın; plazma bonding işleminden sonra tozu temizlemek için PDMS'in desenli tarafına şeffaf bant yapıştırıp çekin.

PDMS'i temiz bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Tüm düzeneği bir fırına yerleştirin ve fırını kademeli olarak 120 °C'ye ısıtın. Bağlanmanın tamamlanması ve PDMS'in orijinal hidrofobik durumuna dönmesi için düzeneği 120 °C'deki fırında gece boyunca bırakın.

Kanalın cam yüzeyini hidrofobik hale getirmek için alternatif bir yöntem, akış portlarına aquae gibi bir kaplama maddesi enjekte etmek ve ardından havayla temizlemektir. Bir mililitrelik bir şırınga ve şırınga iğnesi kullanarak birkaç yüz mikrolitre hava ve ardından yalnızca metal şırınga ucunu dolduracak kadar küçük bir miktar aquil çekin. Aquayı ve ardından temizleyici havayı akış portlarına dikkatli ancak kararlı bir şekilde enjekte edin. PDMS ile cam arasındaki bağı agresif bir şekilde koparmamaya dikkat edin.

Kuruma sonrası kanalları tıkayabilecek çökmelerin oluşmasını önlemek için, fazla suyu silerek tüm giriş ve çıkış portlarında hava temizleme işlemini tekrarlayın. Hücre konsantrasyonunun kontrol edilmesi, uygun sayıda damlaya uygun sayıda hücre ulaşılabilmesi için gereklidir. Bu süreç, zorlayıcı iki bileşen içermektedir.

Birincisi, uygun konsantrasyonun önceden tahmin edilmesi, ikincisi ise deney boyunca bu konsantrasyonun korunmasıdır. Bu çalışmada kullanılan özel cihaz için, kontrollü enkapsülasyon amacıyla 8 ila 15 mikron boyutundaki hücreler veya partiküller yeterli olacaktır. Bu gösterimde, hücre surrogatları olarak 9,9 mikronluk polistiren diari mikrosferler kullanılacaktır; ideal enkapsülasyonu sağlamak için sulu partikül süspansiyon konsantrasyonunu hazırlamak adına, tam sıralama için önceki verileri kullanarak ağırlıkça %1 katı mikrosfer stok konsantrasyonu ile başlayın. Rehber olarak, bir mililitre stok örneği nazikçe santrifüj ederek, 250 mikrolitre süpernatan sıvıyı uzaklaştırıp partikülleri vorteks karıştırma veya daha nazik bir karıştırma ile yeniden süspanse ederek konsantrasyonu %1,5 katıya çıkarın.

Bu videoda gösterilmemiş olsa da, hücreler kullanıldığında hem hücrelerin hem de polistiren partiküllerin özgül ağırlığı birden büyüktür. Birkaç dakikadan saatlere kadar süren uzun vadeli deneyler için, partiküller için kalsiyum klorür veya hücreler için opti prep gibi bir çözünen ekleyerek çözeltinin kaldırma kuvveti dengelenebilir. Hücre veya partikül süspansiyonu hazırlandıktan sonra, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 10 mililitrelik sürekli florokarbon yağ fazı örneği hazırlayıp vorteksleyin.

Sürfaktan ve florkarbon yağı yaklaşık olarak ağırlıkça %2,5 oranında karıştırın. Burada, mikro enkapsülasyon deneyini kurmak için kabul edilebilir olan ağırlıkça %2,4'lük bir karışım elde ediyoruz. İlk olarak, evirtilmiş optik mikroskobun ve yüksek hızlı kameranın gücünü açın.

Mikrokanal katmanına odaklanın ve kanalları tıkanıklıklar ile yerinden çıkabilecek her türlü kalıntı açısından inceleyin. Büyük kalıntılar veya belirgin tıkanıklıklar bulunmayan bir kanal seçin. Ölü hacmi minimize etmek için sulu faz girişi, yağ girişi ve emülsiyon çıkışı için üç parça yarı saydam tigon PVC boru kesin.

Şırınga pompalarından mikroskoba ulaşacak kadar boru kesin. Akış portlarına yerleştirmeyi kolaylaştırmak için boru uçlarını 45 derecelik açıyla kesin ve cımbız kullanarak boru uçlarını akış portlarına bastırarak oturtun. Ardından, sulu giriş borusunun boş ucuna 30 gauge küt uçlu paslanmaz çelik şırınga iğnesini bastırarak oturtun.

Aynı işlemi yağ giriş tüpü için tekrarlayın. Cihazı taşıyın ve tüpleri mikroskop tablasına sabitleyin; 20x objektif kullanarak cihaz nozulunu hizalayın ve odaklayın. Odak düzleminde optimal aydınlatma sağlamak için mikroskobu manuel olarak Kohler aydınlatmasına göre ayarlayın.

Yüksek hızlı kamera yazılımını kullanarak, daha yüksek kare hızlarına izin vermek için nozul çevresindeki görüş alanını kırpın ve ardından optimal kayıt için gerekli kare hızını, pozlama süresini ve diğer kamera ayarlarını belirleyin. Ardından, bir mililitrelik bir şırıngayı daha önceden hazırlanmış ve iyi karıştırılmış sulu faz çözeltisiyle doldurun. Üç mililitrelik bir şırıngayı yağ fazı çözeltisiyle doldurun.

Dolu şırıngalardan birini dikey konuma getirin ve hava kabarcıklarını şırınga çıkışına taşımak için hafifçe vurun. Şırıngayı dikey tutarak, havayı şırınga ucuna itecek kadar pistonu yavaşça bastırın. Şırıngayı, cihaza zaten takılı olan ilgili şırınga iğnesine bağlayın.

Sıvı, boru boyunca cihazın hemen yanına kadar itilene kadar havayı şırınga iğnesinin ölü hacminden geçirmek için pistonu bastırın; ardından şırıngayı bir şırınga pompasına güvenli bir şekilde monte edin ve piston bloğunu yerleştirin. Aynı bağlantı işlemlerini ikinci şırınga için tekrarlayın ve bunu ikinci bir şırınga pompasına monte edin; her bir şırınga pompasını açın ve her pompayı programlayın. Üretici protokollerini kullanarak başlangıç akış hızlarını yağ fazı için 50 µL/dakika ve su fazı için 5 µL/dakika olarak ayarlayın.

Sulu faz başlangıcı için pompalar, her bir sıvının cihaza girmesini ve kanalları doldurarak kalan ölü havayı dışarı itmesini bekler. Başlangıç akış hızları kullanıldığında bu işlem birkaç dakika sürebilir. Nozulda damlaların oluşumunu gözlemleyin.

Uzun sulu çözelti kanalındaki partiküllerin düzenlenmesini gözlemlemek için sulu akış hızını yavaşça artırın. Akış hızı artarken, farklı bir damla oluşturma nozülü kullanılan bu örnekte gösterildiği gibi, nozül başında sulu akışkan akımının jetlenmesine neden olacak noktaya kadar akış hızını artırmayın; buradaki kararsız akışa ve tutarsız damlaya dikkat edin. Eğer partikül konsantrasyonu, nispeten az sayıda eksik partikül içeren ardışık diziler sağlamak için çok düşükse ve örnek kaldırma kuvvetiyle dengelenmemişse, partiküllerin şırınga çıkışlarına doğru kademeli olarak çökelmesini sağlamak için şırınga pompasını fiziksel olarak şırınga çıkışına doğru eğin.

Yeterli düzenlenme gerçekleştiğinde, damla oluşum frekansını ve boyutunu ayarlamak için yağ akış hızını düzenleyin. İstenen enkapsülasyon oranlarına ve damla hacimlerine ulaşmak için her iki akış hızını da iteratif olarak ayarlayın. Kararlı ve düzenli enkapsülasyon onaylandığında, çıkış tüpünü atık rezervuarından çıkararak gelecekteki kullanım için bir toplama rezervuarına aktarın.

Tekli ve çoklu partikül veya hücre enkapsülasyonu yüksek verimlilikle gerçekleştirilebilir. Burada gösterilen bu protokolün kullanımı, dakikada 60 mikrolitre yağ akış hızı ve dakikada dokuz mikrolitre sulu akış hızı ile tekli partikül enkapsülasyonunun temsili bir sonucudur. Damla başına ortalama partikül sayısı olan Lambda, 0,95'tir.

Tam olarak sıralanmış ardışık partiküller için akış yönündeki partikül aralığı yaklaşık 17 ila 18 mikrondur. Bu örnekteki damla oluşturma hızı, 24,4 pikolitre ortalama damla boyutu ile 6,1 kilohertz'dir. Histogram, tek partikül enkapsülasyonu ile artı durumunun damla enkapsülasyon partikül verimliliğini karşılaştırmaktadır.

İstatistiklere gelince, 517 damlacık örneği için rastgele enkapsülasyon oranında, tek parçacık içeren damlacıkların ortalama oranı, öngörülen %36,7'lik rastgele enkapsülasyon oranının aksine %79,5'tir. 491 parçacıktan oluşan bir örneklemde, doğru şekilde enkapsüle edilen damlacıklarda yer alan parçacıkların oranının %83,7 olduğu gözlemlenirken, rastgele enkapsülasyon oranı %37,3'tür. Çift parçacık enkapsülasyonu, sulu faz akış hızı dokuz microliter per minute düzeyinde tutulurken, yağ akış hızının 30 microliters per minute değerine düşürülmesiyle kolayca gerçekleştirilir. Burada lambda, yani damla başına ortalama parçacık sayısı 1,8'dir. Bu süreç, tek parçacık enkapsülasyonuna benzer şekilde gerçekleşir.

Tam sıralı alternatif parçacıklar için akış yönündeki parçacık aralığı yaklaşık 17 ila 18 mikrondur. Daha büyük damlalar, rastgele enkapsülasyona kıyasla 39,8 picoliters ortalama damla boyutuna sahiptir ve 3.8 kilohertz hızında oluşmuşlardır. 383 damlalık bir örneklem boyutu için, iki parçacık içeren sıralı enkapsülasyon damlalarının ortalama fraksiyonu, %26,8 olarak öngörülen rastgele enkapsülasyon fraksiyonuna karşılık %71,5'tir. 689 parçacıklık bir örneklem boyutu için, doğru şekilde enkapsüle edilen damlalarda yer alan parçacıkların fraksiyonunun %79,5 olduğu gözlemlenirken, rastgele enkapsülasyon fraksiyonu %33,4 olarak kaydedilmiştir.

Birlikte değerlendirildiğinde bu sonuçlar, hem tekli hem de çiftli partikül enkapsülasyon verimliliklerinin, rastgele enkapsülasyon verimliliklerini iki kattan fazla geride bıraktığını ve istenen sayıda hücre veya partikül içermeyen damlacık sayısını büyük ölçüde azalttığını göstermektedir. Yüksek enkapsülasyon verimliliği için uygun partikül veya hücre konsantrasyonlarının önemi, bu deneysel çalışmada örneklendirilmiştir. Yağ ve sulu faz akış hızları, daha önce gösterilen çiftli partikül enkapsülasyon çalışmasıyla aynı olsa da, damla başına düşen ortalama hücre sayısı lambda 1,57'ye düşürülmüştür.

Sonuç olarak, tam sıralama gerçekleşmez ve böylece dizilerde boşluklar oluşarak beklenenle karşılaştırıldığında daha az parçacık içeren güneş damlacıkları meydana gelir. Bu histogram, Lambda'nın daha düşük değeri nedeniyle iki parçacıklı enkapsülasyon verimindeki azalmayı göstermektedir. 324 damlacıklı bir örneklem boyutu için, iki parçacık içeren damlacıkların ortalama oranı %55.9 olmuş ve tek parçacıklı damlacık sayısı, çift parçacıklı damlacık sayısına yakın çıkmıştır.

Bu durum, seçilen lambda değerinin, damla başına düşen hücrelerin daha az veya daha fazla olmasının tolere edilip edilmediğine bağlı olarak, doğru şekilde kapsüllenmiş partikül veya hücre sayısını maksimize etmek için istenen hücre sayısı ile eşit veya buna yakın olması gerektiğini göstermektedir. Bu demonstrasyonda, deney sırasında konsantrasyonun gerçek zamanlı kontrolünü sağlamak için kaldırma kuvveti uyumsuzluklarından yararlanıyoruz. Ancak, daha uzun süreli deneylerde, hücrelerin sulu damlacıklar içine kapsüllenmesinin ardından daha tutarlı sonuçlar elde etmek için kaldırma kuvvetini eşitlemek tavsiye edilebilir.

Zamana bağlı deneyler, damlaların mikroakışkan dizilere yeniden enjekte edilmesi yoluyla bir santrifüj tüpünde veya bir mikroskop altında gerçekleştirilebilir.