Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Temel Protokol Plus, Sorun ve Optimizasyon Stratejileri

Bu prosedürün genel amacı, az miktardaki başlangıç materyalinden belirli bir DNA segmentinin bol miktarda üretilmesini sağlayan polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR'da yer alan adımları göstermektir. Öncelikle, PCR reaksiyonunda kullanılacak reaktifleri ve malzemeleri hazırlayın, ardından dört deoksiribonükleotid, DNA kalıbı, primerler ve DNA polimerazı içeren reaksiyon karışımını kurun. Sonrasında, termal döngü koşullarını programlayın ve PCR reaksiyonunu gerçekleştirin.

Bunu takiben, reaksiyonun başarılı olup olmadığını belirlemek için sonuçları kontrol edin. Nihayetinde, bir polimeraz zincir reaksiyonu, istenen ürün boyutunda spesifik bir amplikon vermelidir.

Genel olarak, bu protokolle yeni tanışan kişiler, değişken reaktiflerin hesaplamalarını yaparken biraz zorlanabilirler ve bazen pipetleme ile doğru hacimlerin belirlenmesi konusunda, özellikle gliserol içeren polimeraz ile ilgili sorunlar yaşayabilirler. Deneye taze doldurulmuş bir buz kovası ile başlayın. Reaksiyonun kontamine olmasını önlemek için eldiven kullanın.

Karışım ve reaktifler. PCR bileşenlerini tamamen çözülmeleri için buz üzerinde hazırlayın. Bunlar arasında DNA kalıbı primerleri, magnezyum klorürlü veya magnezyum klorürsüz 10 x reaksiyon tamponu içeren DNA polimeraz, deoksınükleotidler, steril su ve magnezyum klorür yer alır.

Magnezyum klorür içermeyen tampon kullanılıyorsa, magnezyum klorür gereklidir. 0,2 mililitrelik ince duvarlı PCR tüpleri için tutucu olarak, bir buz kovasının içine 96 kuyucuklu bir plaka yerleştirin. Şimdi çalışma tezgahını PCR tüpleri ve kapakları ile hazırlayın.

Bir PCR tüp rafı, etanole dayanıklı bir markör ve bir set mikro pipet. Final hacmi 50 µL elde etmek için, kuantum steril distile su ile reaksiyon karışımını detaylandıran bir reaktifler tablosu her zaman oluşturun. Örneğin; magnezyum içermeyen beş µL tampon, bir µL 10 mM dNTPs ve optimize edilmiş 4,0 mM magnezyum kullanın.

Her bir 20 µM primerden 1 µL, 2 ng/µL kalıptan 0,5 µL ve 0,5 µL polimeraz kullanımı, sadece 33 µL steril su gerektirecektir. 10 x tampon çözeltide mevcut değilse veya PCR optimizasyonu için gerekliyse magnezyum klorür ekleyin.

PCR tüplerini, her bir reaksiyon tüpü için etanol dirençli bir markörle etiketleyin. İlk olarak hesaplanan miktarlarda steril su ekleyin, ardından 10 x tampon ve 10 millimolar DN NTPs ekleyin. Bu reaksiyon için magnezyum klorür ile bir titrasyon gerçekleştiriyoruz.

Magnezyum konsantrasyonu sabit olmayacağı için, magnezyum klorür PCR tüplerine ayrı ayrı eklenir ve her bir PCR tüpüne toplam 40 µL nihai master mix gelecek şekilde hacim steril su ile 10 µL'ye tamamlanır. 50 µL'lik reaksiyonu ve magnezyum klorür miktarını tamamlamak için DNA kalıbını ve primerleri eklemeye devam edin. Son olarak, 1,8 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü içerisinde her 50 µL'lik reaksiyon başına 0,5 ila 2,5 ünite DNA polimeraz ekleyin.

Kontrollerin yanı sıra pipet transfer kaybını da karşılayacak miktarda bir ana karışım (master mix) çözeltisi hazırlayın. Bir mikro pipeti toplam çözelti hacminin yaklaşık yarısına ayarlayın ve pipetleme yaparak nazikçe karıştırın. Her bir test örneği için PCR tüpüne ana karışım ekleyin.

Şimdi, kalıp DNA içermeyen negatif kontrol için tüm reaktifleri ekleyin ve eksik olan DNA hacmini tamamlamak için steril su kullanın. Ardından pozitif kontrol için, deneysel PCR örnekleriyle aynı koşullar altında bilinen bir fragmanı amplifiye eden bir kalıp DNA ve primer seti kullanın. PCR termal döngüleyici cihazlar, reaksiyon karışımını hızla ısıtıp soğutarak dupleksin ısı ile indüklenen denatürasyonuna, primerlerin DNA kalıbının artı ve eksi zincirlerine bağlanmasına ve PCR ürününün uzamasına olanak tanır.

Döngü süreleri, genel formül için kalıbın boyutuna ve DNA'nın GC içeriğine göre belirlenir. Kalıbın başlangıç denatürasyonu ile başlayın, ardından üç aşamalı bir sıcaklık döngüsü programının 25 ila 35 turunu başlatın. Bu döngülerin ilk adımı, DNA kalıbını denatüre etmektir.

Ardından, primerlerin görünür erime sıcaklığının yaklaşık beş derece Celsius altına gelecek şekilde optimal bir bağlanma sıcaklığı programlayın ve bunu, polimerazı DNA kalıbına getirmek ve PCR ürününü sentezlemek için uzama adımı ile takip edin. Şimdi döngü sayısını girin. Sonraki programı ayarlayın.

Amplikonların sentezini tamamlamak için uzatılmış bir uzama basamağı uygulanır. Son olarak, karışım dört derece Celsius'a soğutularak bir sonlandırma basamağı eklenir. Standart PCR koşulları istenen amplikonu vermezse, daha iyi sonuçlar elde etmek için PCR optimizasyonu gereklidir.

Dolayısıyla, reaksiyonlar ilk seferde çalışmadıysa, reaksiyondaki sorunu gidermeye çalışmalısınız. Bu nedenle öncelikle sorunun insan hatasından kaynaklanmadığından emin olmak istersiniz. Bu durum, bir pipetleme hatası yaptığınızda veya test tüplerinden birine bir reaktifi eklemeyi unuttuğunuzda meydana gelebilir.

Ardından, termosaykler kurulumunu değiştirmek amacıyla koşulun bazı katılıklarını değiştirmeyi deneyebilir veya alternatif bir yöntem olarak magnezyum konsantrasyonunu değiştirebilirsiniz. Sorunları gidermek için reajene bazı katkı maddeleri eklemeyi de deneyebilirsiniz. Alternatif olarak, başlangıç denatürasyon süresinin önemli ölçüde artırıldığı çok yönlü bir modifikasyon olan hot start PCR'ı değerlendirin.

S seia genomik DNA'sından GAL üç geninin PCR ürünlerini ayırmak için AROS jel elektroforezi uygulanarak, bu reaktif seti için optimal magnezyum iyonu konsantrasyonu belirlenir; dikkat ediniz, beklenen boyuttaki 2098 baz çiftlik PCR ürünü 2,5 millimolar magnezyum konsantrasyonundan itibaren görülmekte ve optimal konsantrasyon dört millimolar olarak saptanmaktadır. Farklı DNA şablonlarının amplifikasyonunda, istenen PCR ürününün belirgin bir bant olarak elde edilmesi için iki millimolar magnezyum gereklidir. Reaksiyonun stringensini düşürerek etkili bir şekilde suboptimal amplifikasyon koşulları oluşturmak, spesifik olmayan ürünlerden oluşan bir yayılmaya (smear) neden olur.

Ayrıca, reaksiyonun genel sertliğinin azaltılmasıyla, bir amplikon oluşturmak için daha düşük miktarda magnezyum iyonuna ihtiyaç duyulur. Bu nedenle, değişkenleri göz önünde bulundurarak PCR'ın optimize edilmesi, hedeflenen spesifik ürünün elde edilmesini sağlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir polimeraz zincir reaksiyonunun nasıl kurulacağı ve hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Amaç, her bir PCR'ın değişkenlerini anlamak ve istenen amplikonu oluşturmak için bu değişkenlerin nasıl manipüle edilebileceğini kavramaktır.