Sinirler, yolları ve Floresan Boyalar ile Spinal Roots Retrograd Yükleniyor

Bu prosedürün genel amacı, basit ve düşük maliyetli bir teknik kullanarak nöronlara veya herhangi bir nöronal yola yüksek konsantrasyonda floresan veya iyon duyarlı boya aktarmaktır. Bu işlem, öncelikle tip bir ve tip iki olmak üzere iki tip pipet üretilerek gerçekleştirilir. Ardından, tip bir pipete esnek bir elastomer tüp bağlanır ve hedef nöronal yolun tip bir pipete çekilmesi için pozitif basınç uygulanarak iyi bir sızdırmazlık sağlandığı doğrulanır.

Ardından, tip iki pipeti tip bir pipetin içine yerleştirin ve tip bir pipette kalan A CSF'yi aspire etmek için tip iki pipeti kullanın. Daha sonra, tip bir pipete hava kabarcığı oluşturmadan boyayı ekleyin. Son adım, nöronları karanlıkta 6 ile 20 saat arasında inkübe etmektir.

Son olarak, tip bir pipet çıkarıldıktan sonra, preparat in vitro, elektrofizyolojik veya morfolojik çalışmalar için hazır hale gelir. Bu tekniğin banyo uygulaması, BOS enjeksiyonu ve elektroporasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, D'nin tanımlanmış bir nöronal popülasyona iletilmesidir. Bu yöntem; tanımlanmış nöronların aktivitesi, bağlantısallığı, morfolojisi ve dağılımı gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Genel olarak teknik pratik gerektirir; özellikle boyanın tip bir pipet içinde seyrelmemesini ve içine hava kabarcığı girmemesini sağlamak önemlidir. Bu prosedüre, konik uçlu iki kısa pipet oluşturmak için polietilen tüpü bir alkol lambasının alevi üzerinde çekerek başlayın. İlk olarak, hedef kökü veya yolu sıkıca tutabilecek küçük uçlu kısa bir tip bir pipet çekin.

Ardından, tip bir pipetin ucuna kadar yerleştirilebilen, daha uzun ve ince bir gövdeye ve çok ince bir uca sahip tip iki bir pipet alın. Sonrasında, tip iki pipeti 19 gauge'lik EC klipsli iğneye bağlayın. Daha sonra izole edilen omuriliği bir banyoya yerleştirin.

Yükleme işlemi boyunca soğutulmuş A CSF ile süper füzyon gerçekleştirin. Ardından, tip 1 pipeti, arka açıklığının esnek bir tüp aracılığıyla bir şırıngaya kolayca bağlanabileceği şekilde bir elektrot tutucuya yerleştirin. Bu prosedürde, önce bir şırınga kullanarak tip 1 pipetin içine CSF çekin.

Ardından, doldurulacak olan aksonal yol veya kökü çizin. Daha sonra esnek tüpü arka açıklıktan çıkarın. Bundan sonra, tip iki pipeti başka bir şırıngaya takın.

Bunu, mikroskop altında bir aksonal yolak veya nöronal kökü tutan birinci tip pipete yerleştirin. Kalan A CSF'nin aksonal yolağı sadece kaplayacak kadar olması için, ikinci tip pipete takılı olan şırıngayı kullanarak A CSF'yi aspire edin. Ardından, ikinci tip pipeti birinci tip pipetten geri çekin.

Aksonal yol veya sinirlerin iyi mühürlendiğini doğrulamak için A CSF seviyesini birkaç dakika boyunca izleyin. Ardından, boyayı A CSF veya çift distile su içindeki %0,2 Triton X 100 ile çözün. Hava kabarcığı çekmemeye dikkat ederek, bağlı şırıngaya hafif negatif basınç uygulayarak çözeltiyi iki numaralı pipete çekin.

Ardından, boya içeren iki numaralı pipeti kalıntı A CSF solüsyonunun içine yerleştirin. Bir numaralı pipette, şırıngaya hafifçe pozitif basınç uygulayarak boyayı yavaşça A CSF içine salın. Herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadığınızdan veya hedef dokunun uç içinden yerinden oynamasına neden olmadığınızdan emin olun. Boya enjekte edilirken bir numaralı pipete bir hava kabarcığı girerse, iki numaralı pipet ucunu kabarcığa yaklaştırıp ardından bağlı şırıngayı kullanarak hafif bir negatif basınç uygulayarak kabarcığı dışarı çekin.

Yeterli miktarda boya salındıktan sonra, tip iki pipeti geri çekin. Ardından, deneyin türüne bağlı olarak dokuyu altı ila 20 saat boyunca karanlıkta inkübe edin. Dolum için yeterli süre geçtikten sonra, elektrodu dokudan nazikçe çekerek çıkarın.

Ardından doku, görüntüleme veya histoloji için hazır hale gelir. Burada, motor nöronlara, duyusal afferentlere ve spinal internöronlara aynı anda üç farklı konjuge floresan boyalı dekstranın yüklendiğini gösteren şematik bir diyagram yer almaktadır; motor nöronlar ve sakral duyusal afferentler, sırasıyla ventral ve dorsal kökler aracılığıyla Cascade blue Dekstran ve Texas red dekstran ile geri doldurulmuştur. Aksonları ventral funikulus üzerinden yükselen spinal internöronlara ise yeşil floresan dekstran yüklenmiştir.

Burada, nöronların geriye doğru etiketlendiği sakral omurilikten bir kesitin konfokal görüntüsü gösterilmektedir. Etiketli duyusal afferentlerin öncelikle ipsilateral olduğuna dikkat edin. Birkaç kontralateral projeksiyonla birlikte, etiketli motor nöronlar dolu ventral köke göre ipsilateraldir; buna karşılık, ok ucuyla belirtildiği gibi etiketli internöronlar buna kontralateraldir.

Bu prosedürün ardından; fonksiyonel bağlantısallık, eksitatör inhibitör dengesi, sinüs tipi, dağılım ve DI alan nöronlarındaki nörotransmitter üretimi gibi temel soruları yanıtlamak amacıyla ek yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, omurilik ve beyin sapı nörofizyolojisi alanındaki araştırmacıların, iyon duyarlı boyalar kullanarak spesifik nöronal popülasyonları belirlemelerine yol açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, izole edilmiş omurilikteki nöronlara ve duyusal liflere floresan ve/veya iyon duyarlı boyaların nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.