Bir Fonksiyonlu Bis-Peptid Katı Faz Sentezi Metodolojisi "Güvenlik" Catch Kullanımı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, katı faz tekniklerini kullanarak fonksiyonelleştirilmiş bir BSP peptit sentezlemektir. Bu işlem, korumalı bir BIS amino asidinin hidroksietil benzoik asit reçinesine yüklenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, fonksiyonelleştirilmiş bis amino asitleri eklemek için derin koruma kenetleme döngüleri tekrarlanır; bu süreç BIS peptidini uzatır ve istenen fonksiyonelliği sağlar.

Son olarak, DI Keto pirazin oluşumu yoluyla BIS peptidini reçineden ayırmak için ilk bis amino asit, bir alfa amino asit ile modifiye edilir. Sıvı kromatografisi kütle spektrometrisi analizi baz alındığında, fonksiyonelleştirilmiş bir BSP peptidinin iyi ham saflıkta ve yaklaşık %10'luk tutarlı izole verimlerle başarılı bir şekilde sentezlendiğini gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin etkileri, bis peptidlerin katı bir reçine üzerinde birleştirilmesi nedeniyle paralel ve kütüphane sentezlerine kadar uzanmaktadır; zira bu yöntem, çözeltideki reaksiyonlara göre daha kolay manipüle edilebilir ve yan ürünler filtrasyonla kolayca uzaklaştırılabilir.

Birçok adımın öğrenilmesinin zor olması nedeniyle bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır; çünkü tüm reaksiyonların mümkün olduğunca tamamlanmasını sağlamak için birçok önemli detaya ihtiyaç vardır. Katı faz sentezinde ara ürünleri saflaştırmanın bir yolu yoktur. Bu nedenle, temiz bir nihai ürün elde etmek için her reaksiyon mümkün olduğunca ileri götürülmelidir.

Adımlar doğası gereği tekrarlayıcı olduğundan, karışıklığı önlemek için deneysel prosedürlerin bir kontrol listesini oluşturmanızı öneririz. Bu protokol, ilk BSP peptidinin yüklenmesi, ilk BSP peptidinin korunması ve eş zamanlı reçine kaplaması ile başlar. Başlamak için, sekiz mililitrelik bir reaksiyon kabına 114 miligram H-M-B-A-A reçinesi tartarak ekleyip bir manyetik karıştırma çubuğu koyarak ilk BSP peptidini yükleyin.

Kabın üstünü kauçuk septayla kapatın ve tüpü en az beş dakika boyunca argon ile süpürün. Bu sırada, yazılı protokolde açıklandığı şekilde aktive edilmiş BIS amino asit çözeltisini hazırlayın. Bu videoya eşlik eden işlemle, çözeltiyi şırınga yardımıyla reaksiyon kabına aktarın ve argon altında gece boyunca karıştırın; ertesi gün septayı çıkarın ve reaksiyon karışımını boşaltın.

Reçineye yaklaşık iki mililitre klorometan ekleyerek reçineyi yıkayın. 30 saniye ile bir dakika arasında karıştırın ve ardından süzün. Bu işlemi DCM ile dört kez tekrarlayın ve ardından reçineyi beş kez dimetilformamid ile yıkayın.

Birinci bis amino asidin derin korunmasını ve eş zamanlı reçine kaplamasını gerçekleştirmek için, reaksiyon kabına asetik asit ve DCM içinde %33'lük hidrojen bromür çözeltisinden iki mililitre yavaşça ekleyin. Reçineyi boşaltıp DCM ile beş kez yıkadıktan sonra 15 dakika boyunca karıştırmaya bırakın. D koruma sekansını bir kez daha tekrarlayın.

Ardından, reçineyi beş kez DCM ile, ardından beş kez DMF ile yıkayın; reçineyi, DMF içinde %5 hacimce/hacimce D-I-P-E-A çözeltisi ile iki kez yıkayarak nötralize edin. Daha sonra beş kez DCM ve beş kez DMF ile bir kez daha yıkayın. Artık korumalı fonksiyonelleştirilmiş bis amino asidin kenetlenmesi gerçekleştirilebilir.

Öncelikle, reçine içeren reaksiyon kabını anhidroz DCM ile üç kez yıkayarak inert atmosferi yeniden sağlayın. Ardından bir septum ve argon hattı temizleme düzeneği takın; kaba bir ila iki mililitre anhidroz DCM ekleyip 30 saniye boyunca karıştırarak kabı yıkayın. Daha sonra, argon hattı kabarcıkları yükselmeye başlayana kadar kabı boşaltın.

Bu işlemi en az bir kez daha tekrarlayın. Ardından, alevle kurutulmuş bir deney tüpünde, argon atmosferi altında fonksiyonelleştirilmiş bis amino asit çözeltisi hazırlayın. 47 µL DIC ekleyin ve 90 dakika boyunca karıştırın.

Ardından, reçineye 666 µL hidrus DMF içerisinde 35 µL D-I-P-E-A ekleyin ve beş dakika daha karıştırın. Önceden aktive edilmiş BIS amino asit çözeltisini şırınga yardımıyla kaba aktarın ve ertesi güne kadar gece boyunca karıştırın. Reaksiyon karışımını süzün ve argon altında anhidroz DCM ile iki kez yıkayın.

Bu prosedürdeki kritik bir adım bis amino asit kenetlenmeleridir. Di keto piperazin halka kapanmalarını sağlamak için, ek aktive edici ajanlar ile daha uzun reaksiyon süreleri uyguluyoruz. Di keto pirazinin kapanmasını teşvik etmek için, bir HOAT ve DIC çözeltisi ekleyin ve argon altında bir saat boyunca karıştırın.

Ardından, septumu çıkarın ve reaksiyon karışımını süzün. Reçineyi beş kez DCM ile ve beş kez DMF ile yıkayın. Bu bölüm, fonksiyonelleştirilmiş BIS amino asidin derin korumasını, Fmoc'un derin korumasını ve ilk BIS amino asidin asilasyonunu kapsamaktadır.

Korunan fonksiyonelleştirilmiş bis amino asidin derin korumasını gerçekleştirmek için, TFA ve TIPS çözeltisinden iki mililitreyi reaksiyon kabına yavaşça ekleyin ve bir saat boyunca karıştırın; ardından süzün, reçineyi yaklaşık 30 saniye boyunca DCM ile yıkayın ve süzün, DCM yıkamasını beş kez tekrarlayın. Daha sonra, A-D-C-M-D-M-F yıkama sırasını takip ederek tüm derin koruma reçine yıkama dizisini tekrarlayın. Reçineyi, DMF içinde %5 hacimsel D-I-P-E-A çözeltisi ile iki kez yıkayarak nötralize edin.

Ardından bir D-C-M-D-M-F yıkama işlemi daha gerçekleştirin. Bu aşamadan itibaren BIS peptidi, diğer fonksiyonelleştirilmiş bis amino asitlerle uzatılabilir veya öncü azot karboksilik asidi üzerinden fonksiyonelleştirilebilir ya da her ikisi birden yapılabilir. FM grubunun korumasını kaldırmak için, DMF içinde %20 piperidin içeren iki mililitrelik bir çözelti ekleyin ve reaksiyonu 20 dakika boyunca karıştırın.

Reçineyi süzün ve DMF ile beş kez yıkayın. Bu işlemi, reçineyi ek bir kez daha yıkadıktan sonra bir kez daha tekrarlayın. Son adım olarak, hazırlanan amino asit çözeltisini reaksiyon kabına ekleyip altı saat boyunca karıştırarak ilk bis amino asidi izole edin.

Reçineyi beş kez DCM ve beş kez DMF ile yıkayın. Bu protokolün son bölümü, reçineye bağlı amino asitten Bach grubunun uzaklaştırılmasını ve reçineden ayrılmayı içerir. İlk olarak, reaksiyon kabına iki mililitre bire bir T-F-A-D-C-M çözeltisi ekleyin ve 30 dakika boyunca karıştırın.

Reçineyi süzün ve DCM ile beş kez yıkayın. Ardından bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. Reçineyi 30 saniye boyunca, beş kez DCM ve beş kez DMF ile yıkayıp süzün.

Ardından, susuz DMF içinde %10 D-I-P-E-A çözeltisinden iki mililitre ekleyin ve 24 ila 48 saat boyunca karıştırın. Son olarak, reaksiyon karışımını önceden tartılmış bir yuvarlak tabanlı balona toplayın. Bu çözeltiden 30 µL'yi, bir LC-MS şişesindeki 450 µL Tetra Hydro FU içine aktarın ve analiz için gönderin.

Reçineyi ek DMF porsiyonlarıyla yıkayın ve yuvarlak tabanlı balona toplayın. Sentez boyunca reçine üzerindeki kimyasal dönüşümleri izlemek için aşağıdaki yöntemler kullanılabilir. Serbest hidroksil gruplarını saptamak için, önce tek kullanımlık bir pipet yardımıyla yaklaşık bir miligram kuru reçine alarak metil kırmızısı testini gerçekleştirin.

Dört mililitrelik bir reaksiyon kabına aktarıp durulayın. Metinde açıklandığı şekilde hazırlanan bir metil kırmızı çözeltisi ekleyin ve beş ila 10 dakika boyunca karıştırın. Reçineyi süzün ve beş kez DCM ile yıkayın; turuncu veya kırmızı renkli reçine boncukları serbest hidroksil gruplarının varlığını gösterir.

Bu test, ilk bis amino asit yükleme ve reçine kapatma basamaklarını değerlendirmek için kullanılabilir. İkincil araçları tespit etmek için, tek kullanımlık bir pipet yardımıyla yaklaşık bir miligram kuru reçineyi küçük bir şişeye aktararak kloral testini gerçekleştirin. Hem 0,8 milimolar DMF çözeltisindeki kloralden hem de DMF çözeltisindeki %2'lik asit aldehitten üçer damla ekleyin.

Ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika bekletelim. Bu durumda, mavi veya mor reçine boncukları, reçineye bağlı bileşiğin üzerinde serbest sekonder aminlerin bulunduğunun bir göstergesidir. Aktivasyon verimliliklerini doğrulamak için aktivasyon tuzak testini gerçekleştirin; sentez sırasındaki aktive bileşik, aktive çözeltiden 5 ila 10 µL'nin, 50 µL olain içeren bir sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi flakonuna aktarılması ve elle karıştırılmasıyla değerlendirilebilir.

Çözelti birkaç saniye boyunca sarı renge dönmeli, ardından 450 µL tetra hydro uran ile seyreltilmeli ve lc MS analizine sunulmalıdır. Nihai ürün ve aktive edilmiş ara ürünler, C 18 ters faz kolonla donatılmış bir LC MS sistemi ve 0.1% formik asit içeren su asetil nitril çözücü sistemi kullanılarak değerlendirilebilir. Bu L-C-M-S-U-V izi, ham ürünün yüksek saflığına bir örnek teşkil etmektedir.

Spektrumda 21.3 dakikada tespit edilen ana pikin, beklenen ürün kütlesiyle uyumlu bir kütleye sahip olduğu görülmüştür. Bu durum, ham ürünün kütle spektrumunda; kütleye ek olarak sodyum iyonunun kütlesine ve kütleden IV DDE koruyucu grubun kütlesinin çıkarılmış haline karşılık gelen ana piklerin görülmesiyle görselleştirilebilir. Burada, 21.3 dakikada çok saf bir ürünü gösteren saflaştırılmış spektrumların LCMS UV izi ve bu saflaştırılmış trier pikinin kimliğini doğrulayan kütle spektrumu sunulmuştur.

Bu videoyu izledikten sonra, geliştirilmiş katı faz tekniklerini kullanarak fonksiyonelleştirilmiş bis peptitlerin nasıl sentezleneceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu teknik, bir kez ustalaşıldığında, bis peptit alanındaki araştırmacıların protein-protein etkileşimleri ve kataliz uygulamalarını keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Doğru şekilde uygulandığında, bu teknik dört ila beş gün içinde fonksiyonelleştirilmiş bir bis peptit trimerinin sentezlenmesini sağlayabilir.

Bu prosedürü uygularken, boncukların reaksiyon ve yıkama çözeltileri içerisinde daldırılmış halde tutulmasının önemli olduğunu unutmayın. Stereokimyanın veya alternatif fonksiyonelliklerin protein bağlanması veya katalitik aktivite üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak için paralel sentez veya kütüphane sentezi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Organik reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve çeker ocak kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.