Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

Bu protokol, basit bir kantitatif sıvı faz afinite yakalama analizini göstermek için poliovirus ile Poliovirus tanıyan nanobodylerin etkileşimini kullanmaktadır. Temel olarak, etiketli proteinlerin yanı sıra etkileşime giren radyoaktif işaretli proteinleri çöktürmek için kobalt kaplı manyetik boncuklar kullanılır. İlk olarak, işaretli ve etiketli proteinleri karıştırın ve oda sıcaklığında inkübe edin.

Ardından, etiketi tanıyan manyetik boncuklar ekleyin ve mıknatısları kullanarak etiketli proteinin bağlanan fraksiyonunu bağlanmayan fraksiyondan ayırın. Sonrasında, bağlanmayan fraksiyonda bulunan etiketli proteinin sinyalini ölçün ve bağlanmayan fraksiyonda bulunan etiketli protein miktarını belirleyin. Bu sıvı faz afinite analizinden elde edilen sonuçlar, konformasyonel dönüşüme duyarlı proteinler analiz edildiğinde son derece faydalıdır.

Bu sıvı faz afinite yakalama deneyi, poliovirüsü tanıyan nanobody'ler ile farklı poliovirüs antijenleri arasındaki etkileşime dair bilgi sağlayabilir. Yöntem, proteinlerden birinin işaretlenebildiği ve diğerinin tespit edilebildiği diğer protein-protein etkileşimlerine de uygulanabilir. Bu yönteme dair ilk fikir, poliovirüsü tanıyan nanobody'ler ile farklı poliovirüs antijenleri arasındaki etkileşimi incelemek istediğimizde ortaya çıkmıştır.

Poliovirüs konformasyonel değişime duyarlı olduğu için, katı bir yüzeye bağlandığında e LSA kullanımı sınırlıdır. Bu nedenle sıvı faz tabanlı bir sistem tercih edilmelidir. Poliovirüs araştırmalarında sıkça kullanılan böyle bir sıvı faz tabanlı sisteme örnek olarak mikro protein gösterilebilir.

Bir immünopresipitasyon deneyi. Bu testin uygulanabilirliği kanıtlanmış olsa da, nanobodilarda bulunmayan konvansiyonel bir antikorun kristalize yapısını gerektirmektedir. İlgi çekici ve oldukça kararlı tek alan antikorları olan bu nanobodiler, farklı metinlerle kolayca mühendisleği yapılabilmektedir.

Yaygın olarak kullanılan His etiketi, nikel ve kobalt gibi bivalent iyonlara afinite gösterir; bu iyonlar ise sırasıyla manyetik boncuklara kolayca kaplanabilir. Bu nedenle, kobalt kaplı manyetik boncuklara dayalı basit bir kantitatif afinite yakalama testi geliştirdik.

Manyetik boncuk stokunu vorteksle karıştırın ve her örnek için 10 µL'yi bir tüpe aktarıp boncukları bir mıknatıs kullanarak çöktürün. Boncukları yıkamak için şeffaf süpernatantı uzaklaştırın. 150 µL bağlama tamponu ekleyin.

Boncukları bir mıknatıs kullanarak toplayın ve ikinci yıkamadan sonra süpernatantı uzaklaştırın. Her bir kontrol örneği için boncukları 40 µL bağlanma tamponunda yeniden süspanse edin. Birinci örnekteki arka plan için, radyoligandlı virüs içermeyen ancak kontrol için eşit hacimde bağlanma tamponu içeren bir kuyucuk hazırlayın.

%100 radyoaktiviteye sahip iki örnek alın. Nanobody yerine bağlama tamponu koymak dışında, tüm bileşenleri bir kuyucuğa ekleyin. Şimdi, toplam 80 µL bağlama tamponu hacmi içinde, tüm örneklere dakika başına 2000 sayım S 35 işaretli poliovirüs yedi suşu tip bir ekleyin.

Kontrolü kabul edin. Birinci örnek. Her örneğe 10 µL nanobody dilüsyonu ekleyin.

Bir çalkalayıcı üzerinde 10 saniye boyunca iyice karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, 40 µL yıkanmış manyetik boncuk süspansiyonu ekleyin ve sürekli çalkalama altında oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, boncukları bir mıknatısla çöktürün ve her örneğin radyoaktivitesini ölçmek için temizlenmiş süpernatantı bir tüpe aktarın, süpernatanttan 50 µL'yi bir sayım şişesine aktarın. Üç mL sintilasyon sıvısı karışımı ekleyin ve bu sintilasyon cihazında okuma yapın.

Kullanılan manyetik boncukları bir tüp içinde su kullanarak karşı akımla çekin ve iki dakika boyunca 500 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve boncukları altı mililitre 0,5 molar sodyum hidroksitte yeniden süspanse edin. Ardından süspansiyonu birden fazla tüpe paylaştırın ve beş dakika boyunca ultrasonik banyoda inkübe edin.

Boncuklar bir mıknatıstla çöktürüldükten ve süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra, her tüpe bir mililitre %2 SDS çözeltisi ekleyin, ardından vortex ve folyo kullanarak beş dakika boyunca karıştırın. Şimdi boncukları toplayın. Her tüpe bir mililitre 0,2 molar pH yedi EDTA ekleyin ve tüpleri beş dakika boyunca ultrasonik banyoda inkübe edin.

Ardından boncukları toplayın, boncukları üç kez bir mililitre su ile, ardından bir mililitre 10 milimolar kobalt klorür çözeltisi ile yıkayın. Tüpleri 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Boncukları bir mıknatıs yardımıyla hasat edin ve bir mililitre bağlanma tamponunda yeniden süspanse edin.

Bir mililitre %20 etanol ile iki kez yıkayın ve son olarak boncukları, mililitre başına 40 miligram konsantrasyonda rejenerasyon sağlanmış boncuklar elde etmek için orijinal %20 etanol hacminde tekrar süspande edin. Kontrol örneği birini %0 radyoaktivite değeri ve kontrol örneği ikisini %100 radyoaktivite değeri olarak ayarlayarak arka plan radyoaktivitesini düzeltin.

Şimdi her bir örnek için, nanovücut tarafından radyo işaretli virüsün genel çöktürülmesinin bir ölçüsü olarak, süpernatanttaki radyoaktivite yüzdesini hesaplayın. Bu deney, poliovirüse özgü PVSS 38 C ve antikorun afinitesini; poliovirüsün doğal antijen, ısıtılmış antijen ve 14 s alt birimleri olmak üzere üç farklı antijeni kullanarak değerlendirir. İlginç bir şekilde, radyo işaretli 14 s alt birimleri içeren örneklerin süpernatantındaki radyoaktivite, PVSS 38 C nanovücut konsantrasyonlarının artışıyla birlikte azalmaktadır. Bu durum, PVSS 38 C nanovücuduna ve dolaylı olarak manyetik boncuklara bağlanan Poliovirüs 14 s alt birimi miktarındaki artışı göstermektedir.

pvs S 38 C'nin poliovirusün N antijenik ve H antijenik formlarına karşı herhangi bir afinitesi gözlemlenmediğinden, nanobody'nin poliovirusün 14 s alt birimine özgü olduğu görülmektedir. Bu yöntemle ölçülen nanobody'nin antijenlerine karşı afinitesi, ilişkisiz nanobody ile karşılaştırıldığında özgündür. NB one, poliovirusün üç antijenik formuna karşı herhangi bir reaktivite göstermemektedir.

Farklı araştırmacılar tarafından farklı günlerde oluşturulan bu doz-yanıt eğrisinde belirtildiği üzere, bu sistem yüksek tekrarlanabilirlik sağlar. Uzmanlaşıldığında, bu güvenilir sıvı fazlı afinite yakalama analizi, kullanılan boncukların geri kazanımı dahil olmak üzere iki saat içinde uygun şekilde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, özellikle katı faz temelli sistemlerin kullanılamadığı durumlarda, farklı proteinler arasındaki etkileşimleri incelerken manyetik boncuklara dayalı bu sıvı fazlı afinite yakalama analizinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.