Vahşi Tırtıllar gelen Hemocytes ayıklamak için basit bir protokol

Bu prosedürün genel amacı, yabani tırtıllardan hemositleri ekstrakte etmek, görselleştirmek ve saymaktır. Bu işlem, önce tırtılın buz üzerine yerleştirilerek anestezi edilmesi, ardından antikoagülan içeren bir tampon çözelti enjekte edilmesi ve ekstrakte edilmeden önce hemositlerin yeniden dolaşıma girmesine izin vermek için tırtılın tekrar buza yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, temiz bir bistüri kullanarak tırtılın arka ucunda sığ bir insizyon yapmaktır.

Ardından, tırtıl yumuşak pensler kullanılarak nazikçe sıkılır. Daha sonra, tampon çözelti hemolenf karışımı bir mikro pipet yardımıyla aspire edilir ve bir mikro santrifüj tüpünde toplanır. Son adımda, hemolenf çözeltisi eşit hacimdeki bir tampon çözelti ile nazikçe karıştırılır ve hemositlerin görüntülenmesi ve sayılması için çözeltiden 10 µL bir hemositometre üzerine aktarılır.

Nihayetinde, bu hemosit ekstraksiyon yöntemi, çeşitli tırtıl türlerinden hemositleri saymak için hızlı ve etkili bir yöntem olarak kullanılabilir ve böceklerin hücresel bağışıklık yanıtının fizyolojik yönlerini incelemek için bir araç olarak değerlendirilebilir. Bu tekniğin temel avantajı, prolegs kısmı oldukça küçülmüş tırtıllardan hemositlerin ekstrakte edilmesinde kullanılabilmesidir. Diğer tırtıl modellerinde ise prolegs kısımlarından biri kesilerek kan alma işlemi yapılır ve dışarı çıkan sıvıdan hemositler ekstrakte edilir.

Ayrıca, bu teknik diğer böcek türlerinden hemosit ekstraksiyonu yapmak için de kullanılabilir. Bu yöntem, böcek hücresel bağışıklık yanıtının diyet kalitesine, gelişim evresine veya farklı patojenlere maruz kalmaya göre nasıl değiştiği gibi eko-immünoloji alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu prosedüre başlamak için, hemosit ekstraksiyonundan önce sondan bir önceki instardaki larvaları 20 dakika boyunca buz üzerinde soğutarak anestezi uygulayın.

Ardından, temiz bir 16 gauge kapiler iğnenin küt ucunu, 20 milliliter cam şırıngaya bağlı olan boruya yerleştirin. Toplama çözeltisini içeren tüpü laboratuvar tezgahı üzerinde açık bırakın. Kapileri yavaşça yaklaşık 10 ila 15 µL tampon çözelti ile doldurun.

Ardından iğneyi, diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirilmiş bir kil topağına dayayın. Tırtılı bir Petri kabına yerleştirin. Kürecikler net bir şekilde görülecek şekilde böcek yan yatırılmalıdır.

Stereomikroskop altında gözlem yaparken, tırtılı bir pens yardımıyla sabit tutun ve iğneyi, böcek kütikülünün genellikle daha yumuşak olduğu küresel bölgelerden birinin yakınına yerleştirin. Ardından, kapiler iğneyi böceğin vücuduna nazikçe bastırın. İğne kütikülü deldiğinde, solüsyonun toplam hacmini tırtıla enjekte edin.

Enjeksiyondan sonra tırtılın vücudu şişecektir, ancak patlamamalı veya sızdırmamalıdır. Tırtılı buzlu Petri kabına geri koyun. Tampon çözeltinin yaradan dışarı sızmasını önlemek için böceği sırt üstü konumlandırın.

Hemo limf ekstraksiyonu için kullanılan her tırtıl için enjeksiyonları tekrarlayın. Ardından tüm böceklerin 30 dakika boyunca buz üzerinde soğumasına izin verin. Şimdi, tırtılı diseksiyon mikroskobu altında bir Petri kabına yerleştirin.

Steril bir skalpel kullanarak, bağırsaklara veya diğer iç organlara zarar vermeden tırtılın posterior bölgesinde yaklaşık iki ila üç milimetre uzunluğunda yüzeysel bir kesi yapın. Ardından, 10 µL'lik bir pipet ucuyla yaklaşık 10 ila 20 µL hemolenf karışımı toplarken, esnek plastik bir pens yardımıyla tırtılı nazikçe sıkın. Yine, iç dokulara zarar vermemeye dikkat edin.

Ardından, tırtıl kalıntılarını atın. Her bir tırtıldan elde edilen hemolenfi, ayrı ayrı etiketlenmiş silikonize, 0,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine toplayın. Daha sonra, tek bir tırtıldan toplanan her hemolenf örneğine yaklaşık 10 ila 20 mikrolitre inkübasyon çözeltisi ekleyin.

Bu adımda hemolenf örneklerini her zaman buz üzerinde tutun. Hemolenf örneğini ve inkübasyon solüsyonunu, hemositleri saymadan hemen önce karıştırın.

Bu işlem, hemositlerin düzgün bir şekilde ayrılmasını sağlar ve topaklanmayı önler. İnkübasyon çözeltisi ile karıştırılmış 10 µL hemolenf örneğini bir hemositometreye aktarmak için temiz bir pipet ucu kullanın. Ardından, bir bileşik mikroskop kullanarak hemositometrenin merkezi ızgarasındaki büyük karelerin en az 15 tanesindeki hemosit sayısını sayın ve kaydedin.

15 karedeki toplam hemosit sayısı toplamını elde etmek için bu değerleri toplayın. Ardından, hemositometreyi ve üzerindeki lamı, distile ve deiyonize su içeren bir yıkama şişesi kullanarak iyice durulayın. Sonrasında Kim wipes ile kurulayın.

Kalan hemo limp örnekleri için prosedürleri tekrarlayın ve her tırtıl için mililitre hemo limp hacmi başına düşen ortalama he sit sayısını hesaplayın. Aydınlık alan mikroskobu görüntüsü, nucle hin ai tırtıllarından ekstrakte edilen he sitleri 20 x büyütmede göstermektedir. Bu prosedürün ardından, toplanan he sitler hücresel bağışıklık yanıtını incelemek için kullanılabilir ve fagositoz, cap, seçici enkapsülasyon ve pH oksidaz aktivitesi gibi analizler kurulabilir.

Ek olarak, böceklerdeki bu hücresel bağışıklık yanıtlarını incelemek amacıyla, daha sonraki analizlerde kullanılmak üzere R-N-A-D-N-A ve proteinler toplanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hemolenf ekstrakte etmek amacıyla tırtıllara nasıl enjeksiyon yapılacağı ve canlı hemositler içeren hemolenfin nasıl toplanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.