Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica

Bu prosedürün temel amacı, yalnızca morfoloji ile ayırt edilemeyen ve genellikle gon grass olarak adlandırılan Retta cylindrica varyetelerini birbirinden ayırabilen, maliyet etkin ve hızlı bir moleküler genotipleme protokolü sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen gon grass varyetesinden doku tanımlanıp izole edilerek gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, toplanan dokudan nükleer ve plazmid DNA'sının ekstrakte edilmesidir.

Ardından, PLAs turn LF bölgesindeki sekans farklarını hedefleyen varyete spesifik primerler ile uygun pozitif ve negatif kontroller kullanılarak, ekstrakte edilen DNA üzerinde polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilir. Son adım, amplifiye edilmiş PCR ürünlerini görselleştirmek için dört PCR reaksiyonunun her birine jel elektroforezi uygulamaktır. Sonuç olarak, toplanan gon otu varyetesi, jel üzerindeki varyete spesifik PCR ürün bantlarının analizi yoluyla belirlenir. İstilacı bitkiler, hem tarımsal hem de doğal kaynaklara ciddi zararlar vererek Amerika Birleşik Devletleri'ne yıllık yaklaşık 3,4 milyar dolara mal olmaktadır.

Cogan otu olarak da bilinen vahşi tip Imperata cylindrica, dünyadaki en kötü 10 istilacı yabancı ot arasında yer almaktadır. Cogan otu, yerli bitki örtüsünü ve dolayısıyla bu bitki örtüsüne bağımlı hayvanları yerinden eden tek türden oluşan stantlar halinde hızla yayılır; bu ot şu anda dünya genelinde 490 milyon hektarda ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 500.000 hektarda istilaya neden olmaktadır. Imperata cylindrica'nın süs varyetesi ise yaygın olarak Imperata cylindrica, Arbra, red Baren ve bizim JBG olarak adlandıracağımız Japon kan otu isimleri altında pazarlanmaktadır. Bu varyetenin kısır ve istilacı olmadığı varsayılmakta olup, kırmızı renkli yaprakları nedeniyle tercih edilen bir tür olarak kabul edilmektedir.

Belirli koşullar altında, Japon kan çimi canlı tohumlar üretebilir ve yabani tip cogan çiminden ayırt edilemeyen tamamen yeşil bir forma geri dönebilir. Görüleceği üzere, her ikisi de yeşil yapraklara sahiptir ve geleneksel süs çeşitlerinden daha büyük yapraklara sahiptirler. Ek olarak, geri dönmüş ve yabani tip bitkiler daha büyük rizomlara sahiptir ve süs çeşidinin aseksüel üreme potansiyeli artmaktadır.

Sürgün verme işlemi, tanımlamanın yalnızca morfoloji yoluyla yapılmasını gerektirir. Bu oldukça zorlayıcı bir görevdir. Moleküler yöntemler, normal görsel yollarla tanımlanamayan istilacı bitkilerin ve bitki materyallerinin doğru bir şekilde ayırt edilmesi için bir araç sağlar.

İstilacı bitkilerin yayılmasını ve girişini engellemek için moleküler yöntemler kritik öneme sahiptir. Bu moleküler protokolün uygulanması, Japon kan çimi revertlerini Kogan çiminden doğru bir şekilde ayırt etme imkanı sağlar. Bu protokol, Kogan çimi ile birlikte bulunmayı ve canlı hibritlerin olası oluşumunu önlemeye yardımcı olabilir.

Bu tekniğin, amplifiye fragman uzunluk polimorfizmi veya A FLP analizi ve DNA dizileme gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, yabani tip kogan otu ile Japon kan otu varyeteleri arasındaki farkı kolayca ayırt edebilen, oldukça maliyet etkin ve hızlı bir moleküler genotipleme tekniği sunmasıdır. Tekniği, laboratuvarımızdan lisans öğrencisi Joseph Hery uygulamalı olarak gösterecektir. İlk olarak, kogan otunun veya Japon kan otunun yetiştiği ve birbirlerinden ayırt edilmeleri gereken bir sahadan bir örnek belirleyin.

Japon kan çimi, parlak kırmızı yapraklarıyla yabani tip Kogan çiminden kolayca ayırt edilir. Ancak, Japon kan çimi revert formu, her ikisinin de süs Japon kan çimine göre daha uzun yeşil yapraklara, daha geniş yaprak alanına ve daha büyük rizomlara sahip olması nedeniyle Kogan çimiyle neredeyse ayırt edilemez. Bu yöntem; taze, dondurulmuş ve yakın zamanda kurutulmuş yaprak dokuları üzerinde uygulanabilir.

Dokuların daha sonraki bir tarihte DNA ekstraksiyonu için saklanması gerekiyorsa, en iyi yöntem dokuyu derhal eksi 80 santigrat derecede dondurup saklamaktır. Kuru saklama gerekliyse, dokuyu bir kağıt zarfa yerleştirin ve zarfı oda sıcaklığında susuzlaştırılmış silika jel veya diğer aktif kurutucular içinde saklayın. Taze doku kullanılacaksa, degradasyonu önlemek için DNA'nın toplandıktan sonra üç saat içinde ekstrakte edildiğinden emin olun.

Bu prosedür, Kyogen tarafından üretilen DNEZ plants mini kitini, üretici talimatlarına göre ancak küçük bir modifikasyonla kullanmaktadır. Prosedür, 100 miligramdan fazla taze veya dondurulmuş dokunun veya 20 miligramdan fazla kurutulmuş dokunun kullanılabileceği şekilde uyarlanmıştır. İlk olarak, soğutulmuş bir havan ve havan eli kullanarak, sıvı azot ile üç turda 100 miligramdan fazla taze veya dondurulmuş yaprak dokusunu veya 20 miligramdan fazla kuru yaprak dokusunu ince bir toz haline gelene kadar öğütün.

Taze veya dondurulmuş dokudan elde edilen dondurulmuş tozu 100 miligramlık alikvotlar halinde tartın. Kuru yaprak dokusu kullanılıyorsa, tozu 20 miligramlık alikvotlar halinde tartın. Bu adımdan sonra, üretici talimatlarına uygun olarak DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin; DNA kalitesi ve miktarı için NanoDrop spektrofotometre testi gibi bir spektrofotometre kullanarak, iyi DNA verimleri microliter başına 50 ile 150 nanogram arasında olmalı ve 260/280 ile 230/280 oranları burada görüldüğü gibi 2,0'a yakın olmalıdır.

Standart %1 AROS jeli kullanarak elektroforez gerçekleştirin. DNA konsantrasyonu yüksekse, RNA kontaminasyonuna bağlı olarak çok az veya hiç izleme (streaking)yle beraber 10 KB'den daha büyük, nispeten iri bantların varlığını doğrulayın ve sonraki adımlar için örnekleri mikrolitre başına 70 nanogram olacak şekilde seyreltin. Bu protokolde kırmızı ve yeşil oklarla belirtilen PCR primerleri, Cogan grass ve Japon kan otu genotiplerinin plastered turn LF spacer bölgesi arasındaki sekans farklarına dayanmaktadır.

Bu farklılıklar, dikey siyah oklarla belirtilen tek nükleotid polimorfizmleri ile insersiyonlar ve delesyonlar şeklinde ortaya çıkar ve varyeteye özgü primerlerin geliştirilmesine olanak tanır. Primerler benzersiz sekansların bulunduğu bölgelere yerleştirilerek belirlenir; primer sekansları, izole edilen her bir DNA örneği için hazırlanan protokolün yazılı kısmında yer almaktadır. Yazılı protokole uygun olarak, her bir primer seti kullanılarak buz üzerinde 0,2 mililitrelik ince duvarlı PCR tüplerinde iki adet 50 mikrolitrelik PCR reaksiyonu kurun. Eğer DNA konsantrasyonu düşükse, toplam reaksiyon hacminin 50 mikrolitrede kalması için nükleaz içermeyen çift distile su miktarı ayarlanarak her bir reaksiyona daha fazla DNA eklenebilir.

DNA örneklerinde bulunan safsızlıkların PCR reaksiyonlarını inhibe edebileceği göz önünde bulundurularak, reaksiyon başına beş mikrolitreden fazla DNA veya toplam hacmin %10'undan fazlası kullanılmamalıdır; tüm PCR reaktiflerinin çalıştığından emin olmak için pozitif kontrolü düzgünce hazırlayın. Pozitif kontrol primerlerini kullanarak, pozitif kontrolle aynı kontrol primer setini ancak ekstre edilmiş DNA yerine çift distile su kullanarak negatif kontrolü hazırlayın; bu noktada, test edilen her örnek için toplam dört PCR reaksiyonu bulunmaktadır. Ardından, ısıtmalı kapaklı bir termosiklatörde, yazılı protokoldeki PCR döngü parametrelerini kullanarak PCR amplifikasyonlarını gerçekleştirin; DNA kalitesine, primerlere, Taq polimeraza veya kullanılan termosiklatör tipine bağlı olarak primer bağlanma sıcaklığı, uzama süreleri ve döngü sayısı için optimizasyon gerekebilir.

PCR reaksiyonları tamamlandığında, PCR ürünlerini standart elektroforez kullanarak %1'lik bir jel üzerinde ayırın. Örnekleri, boya önü jelin toplam uzunluğunun dörtte üçüne ulaşana kadar yaklaşık 120 voltta çalıştırın. Jeli UV ışığı altında görselleştirin ve uygun bir DNA fragmanının amplifiye edilip edilmediğini görmek için ortaya çıkan bantları inceleyin.

Bu temsili jel; Kogan otu, Japon kan otu ve Japon kan otu revert DNA örneklerinden elde edilen PCR ürünlerinin, Kogan otu ve JBG spesifik primerleri ile birlikte yürütülen elektroforez sonuçlarının yanı sıra turn LF pozitif kontrolünü ve şablon içermeyen negatif kontrolü göstermektedir. Turn LF pozitif kontrol primer seti; Kogan otu, Japon kan otu, Japon kan otu revert ve diğer otlar için aynı derecede iyi çalışır ve 890 baz çifti uzunluğunda bir bant ile sonuçlanır. Eğer tüm PCR reaktifleri DNA kontaminasyonundan arınmışsa, negatif kontrol reaksiyonu bir PCR ürünü ile sonuçlanmayacaktır.

Eğer DNA örneği yaban tipi kogan otundan elde edilmişse, Kogan otuna özgü primer setinin kullanıldığı bir PCR reaksiyonu yaklaşık 595 baz çiftinde tek bir bant oluştururken, JBG'ye özgü primerler herhangi bir bant oluşturmayacaktır. Benzer şekilde, eğer DNA örneği JBG veya geri döndürülmüş J-B-G-A-P-C-R reaksiyonundan elde edilmişse, JBG'ye özgü primer setinin kullanımı yaklaşık 594 baz çiftinde tek bir bant oluşturacaktır. Kogan otuna özgü primerler ise herhangi bir bant oluşturmayacaktır.

JBG ve geri dönmüş JBG aynı nükleik asit dizisine sahip oldukları için, dolayısıyla aynı bantlanma modellerine sahip olacaklardır. Bununla birlikte, JBG ile JBG revertleri arasındaki morfolojik farklılıklar oldukça belirgindir; bu nedenle PCR sonuçları aynı olsa da, JBG varyeteleri bitki düzeyinde kolayca ayırt edilebilir. PCR ürünlerinin DNA dizilemesi, farklı cogan otu ekotipleri için DNA dizilerindeki olası değişiklikleri tanımlayabilir.

Bu tekniğin geliştirilmesi, yabani tip K otu ile onun süs varyetesi olan Japon kan otunun geri dönmüş formu arasında kesin ayrım yapabilen ilk basitleştirilmiş moleküler yöntemi sunmaktadır. Bu protokolü kullananların, elde ettikleri sonuçları bildirmek için bizimle iletişime geçmelerini öneririz. Paylaşılan bu bilgiler, Japon kan otunun dağılımı hakkında bilgi sağlanmasına yardımcı olacaktır.

Bu durum aynı zamanda, USDA'deki düzenleyicilerin, oldukça istilacı Cogan otu varyetelerinin yayılımını ve potansiyelle hibridizasyonunu önlemek için gerekebilecek önlemler hakkında bilinçli kararlar vermelerine yardımcı olacaktır.