Üç boyutlu heterotipik

Aşağıdaki deneyin genel amacı, erken evre yumurtalık kanseri gelişiminin üç boyutlu tipik modellerini oluşturmaktır. İlk olarak, primer, normal yumurtalık epitelyal ve fibroblast dokularından türetilmiş H turt ölümsüzleştirilmiş hücre hatları oluşturun. Ardından, yumurtalıkta mevcut olan in vivo mimariyi ve karmaşık hücre-hücre etkileşimlerini yeniden oluşturmak için epitelyal ve stromal hücre hatlarını üç boyutlu S sferoid modellerinde ko-kültürle; stromal-epitelyal etkileşimlerin moleküler özelliklerini incelemek amacıyla organoid kültürlerini tespit edin, boyayın ve spesifik markörlerin ekspresyonunu analiz edin.

Elde edilen sonuçlar, 3D tipik modellerin stromal hücre bölmesindeki değişikliklerin, birlikte kültüre edilen epitelyal hücrelerin fenotipini nasıl etkileyebileceğini göstermektedir. Üç boyutlu tipik modeller; bu hastalığın kökenlerinin araştırılması ve stromal mikroçevrenin tümör başlatma ve gelişimindeki rolünün aydınlatılması gibi, yumurtalık kanseri araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin uygulamaları, diğer 3D kültür yöntemlerine kıyasla hastalık teşhisi ve tedavisine kadar uzanmaktadır.

Bu teknik, daha geniş bir hücre kültürü hacmi yelpazesine ve alt uygulamalara uygulanabilir. Örneğin, 3D homo ve tipik kültürler in vitro ilaç testleri için kullanılabilir. Bu yaklaşım, diğer katı tümör tiplerinin veya benign hastalıkların incelenmesi gibi diğer model sistemlere de uygulanabilir.

Taze over dokusunu, ekstra antibiyotikler ve antifungallerle desteklenmiş ölümsüzleştirilmiş normal over fibroblast büyüme ortamı içerisinde hücre kültürü laboratuvarına taşıyın. Dokuya gevşek şekilde tutunmuş olan epitelyal hücreleri uzaklaştırmak için örneği beş mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, örneği ve PBS'yi temiz bir P 100 kültür kabına aktarın. Steril aletler kullanarak dokuyu ikinci bir kuru ve temiz P 100 kültür kabına transfer edin.

Dokuyu 0,5 santimetrekarelik parçalar halinde kesin ve her bir parçayı ayrı bir P 100 tabağına aktarın. Dokuyu bir milimetrekareden daha küçük parçalar halinde kesmeye devam edin. Ardından 20 mililitre INOF GM medyum ekleyin ve kültürleyin. Faz kontrast mikroskopisi kullanarak hücre büyümesini izleyin.

Hücrelerin 24 saat içinde kaba yapıştığını doğrulayın. Hücre büyümesini faz kontrast mikroskobu ile izleyin; hücreler genellikle 24 saat içinde kaba yapışır. Bir hafta sonra, yapışmayan dokuları aspirasyonla uzaklaştırın, besiyerini yenileyin ve ardından hücre kolonileri yaklaşık 500 mikron boyutuna ulaştığında, bir ila üç hafta boyunca kültürleri haftada iki kez besleyin.

Klonları, tripsin ve kaplanmış klonlama diskleri kullanarak izole edin. Hücrelerin %100 fibroblastik olduğunu doğrulamak için, hücre hattından bir örneği cam lameller üzerine ekleyin ve bir fibroblastik belirteç, bir epitelyal belirteç ve bir endotelyal hücre belirteç için immünofloresan boyama gerçekleştirin.

H Turt pasajının retroviral transdüksiyonundan bir gün önce, normal over fibroblast hücre izolatları tek bir P 100 kaplaçtan üç adet P 100 kaplaça aktarılır. Önceden hazırlanmış viral süpernatan satın alınabilir veya HEC 2 9 3 T hücrelerinin ko-transfeksiyonu için standart protokoller kullanılarak kurum içinde üretilebilir. Poli Hema çözeltisini hazırlamak için 1,5 gram poli hema tartın ve steril bir şişeye yerleştirin.

95 mililitre moleküler biyoloji saflığında absolut etanol ve beş mililitre hücre kültürü saflığında distile su ekleyin. Poly Hema çözeltisini, tamamen çözünene kadar 65 °C sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin. Doku kültürü kaplarını taze hazırlanmış poly Hema çözeltisi ile kaplayın.

Hücre kültürü kaplarını laminar akışlı kabin içerisinde havada kurutun. Daha büyük boyutlardaki kapların veya erlenlerin eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için sallama platformunda hafifçe sallama işlemi uygulanabilir. Polyus çözeltisi çok hızlı kurursa, yüzey pürüzsüz olmayacaktır.

Arzu edilirse, 3D kültüre öncesinde fibroblastlara ön işlem uygulayın; örneğin, senesans indüksiyonu için hücreleri letal altı dozlarda hidrojen peroksit ile ön işleme tabi tutun. 3D heterotopik steroidler oluşturmak için yeterli hücre hazırlamak amacıyla INOF ve epitel hücre kültürlerini in vitro ortamda geri kazanın ve genişletin. Beş dakikalık PBS yıkamasının ardından, poly hema plakasına 15 mililitre besiyeri ekleyin.

Bu sırada, ölümsüzleştirilmiş normal over fibroblast hücrelerini kültür kabından ayırmak için tripsin ekleyin. Üç ila beş dakika sonra, tripsini eşit hacimde kültür medyumu ile nötralize edin ve hücreleri santrifüjlesyon yoluyla toplayın. Hücre peletini beş mililitre medyumda yeniden süspanse edin ve pipetle yukarı aşağı çekerek veya hafifçe vorteksleyerek iyice karıştırın.

Ardından, tripan mavisi kullanarak canlı hücreleri saymak için 10 µL örnek kullanın. Şimdi, poly-hema kaplı plakaya önceden dağıtılmış olan besiyerine 4 milyon INOF hücresi ekleyin. Kültür besiyeri hacmini 20 mL'ye tamamlayın ve 37 °C, %5 CO2 koşullarında inkübe edin.

Sferoid kültürlerini iki ila üç günde bir yeniden beslemek için hücresel agregasyonun çok hücreli sferoidlere dönüşümünü faz kontrast mikroskobu ile izleyin. Plakaları bir pipet üzerine eğimli şekilde yerleştirin. Sferoidlerin çökmesini bekleyin ve tükenmiş medyanın yaklaşık 16 mililitresini beş mililitrelik bir pipet ile dikkatlice uzaklaştırın.

Yedinci günde, kültüre 16 mililitre taze besiyeri ekleyin ve inkübatöre geri yerleştirin. Fibroblastların yanına epitel hücreleri ekleyerek heterotipik kültürler oluşturun. Öncelikle, hücre sayımını yaptıktan sonra, daha önce açıklandığı üzere tripsin kullanarak over epitel hücresi süspansiyonları hazırlayın.

Epitel büyüme ortamından herhangi bir büyüme faktörünün taşınmasını önlemek için INOF GM ortamında bir kez yıkayın. Fibroblast OID kültürlerinin ortamı yenilendikten sonra, epitel hücrelerini, fibroblastların epitel hücrelerine oranı dörtte bir olacak şekilde ekleyin. INOF GM ortamındaki heterotopik OID'ler, sonraki 14 gün boyunca her iki ila üç günde bir tipik olarak beslenir.

İmmünohistokimya için, PHE'yi nötr tamponlu formaldehit ile tespit edin, PHE'yi pellet haline getirin ve formaldehiti %70 etanol ile değiştirin. İnsan dokuları için kullanılan standart protokolleri uygulayarak parafine gömme işlemine geçin. Parafine gömülmüş steroidler, kesitlere ayrılabilir ve H&E veya immünohistokimya kullanılarak spesifik moleküler belirteçlerle boyanabilir.

Alternatif olarak, steroidleri PBS ile yıkayın ve %4 paraformaldehit ile fikse edin. Ardından örnekleri OCT medium içine gömün ve kriyostat kesit alma ile akış sitometrisi analizi için immünofloresan boyama amacıyla şok dondurun. Steroidleri PBS ile yıkayın ve 37 °C'de tripsin veya Accutane sindirimi ile dissosiye edin.

Steroidlerin tek hücre süspansiyonuna tam disosiyasyonu, çözeltinin bir mililitrelik pipet ucuyla aşağı yukarı pipetlenmesiyle desteklenebilir. Hücrelerin aşırı boyutlanmamasına dikkat edin; reaksiyonu eşit hacimde kültür medyumu ile nötralize edin ve süspansiyonu 40 ila 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek hücre kümelerini uzaklaştırın. Ardından hücreleri pelitleyin, PBS ile yıkayın ve sayım yapın; istenen sayıdaki hücreyi facts tamponunda yeniden süspande edin ve üretici talimatlarına göre boyayın. Laboratuvarımızda, erken evre yumurtalık kanseri gelişimini taklit etmek amacıyla kısmen transforme edilmiş yumurtalık epitelyal hücreleri kullandık ve bu hücreleri normal ve senesent yumurtalık fibroblastları ile birlikte kültürledik.

Premenopozal bir yumurtalıkta, hERT ölümsüzleştirilmiş normal yumurtalık fibroblastlarının immünofloresan boyamaları, hem primer normal yumurtalık fibroblastlarının hem de ölümsüzleştirilmiş normal yumurtalık fibroblastlarının fibroblast spesifik protein eksprese ettiğini, ancak sitokeratin yedi eksprese etmediklerini ve vimentin eksprese ettiklerini göstermektedir. 3D form PHE'de tek başına kültüre edilen normal yumurtalık fibroblast hücreleri, iğ şeklinde bir morfoloji ve bol miktarda hücre dışı matris sergiler. Burada, normal yumurtalık fibroblastları, yedi gün boyunca senesansı indüklemek için hidrojen perokside maruz bırakılmış ve ardından 14 gün boyunca kısmen transforme olmuş yumurtalık epitel hücreleri ile birlikte kültüre edilmiştir.

İki hücre tipini ayırt etmek için, elde edilen sferoidler proliferasyon markörü olarak mim one ve epitelyal markör olarak pan sitokeratin için immün boyandı. Verilerin nicelleştirilmesi, yaşlanan mikroçevrenin kısmi olarak transforme olmuş epitelyal hücrelerin neoplastik özelliklerini teşvik ettiğini, buna karşın normal bir mikroçevrenin ise neoplastik ilerlemeyi inhibe ettiğini göstermektedir; hücreler tek tabaka (monolayer) olarak kültüre edildiğinde tespit edilemeyen normal ve malign hücrelerin histolojik özellikleri geri kazanılmaktadır. Örneğin, hücreler sferoid kültüre geçirildiğinde, berrak hücreli over kanseri hücre hatlarının 3D kültürlerinde berrak hücreli over kanserlerinin histolojik özellikleri tespit edilebilirken, aynı hücrelerin tek tabaka kültürlerinde bu özellikler tespit edilememektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, erken tümör oluşumu sırasında epitel ve stromal hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için üç boyutlu tipik kültürlerin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. 3B kültür kurulumu yaparken, işlem sırasında meydana gelebilecek bir miktar materyal kaybını göz önünde bulundurarak hücre sayılarını sonraki uygulamalara göre ayarlamak önemlidir.

Bu prosedür takip edildiğinde, 3D kültürler uzmanlaşıldıktan sonra bir saat içinde kurulabilir. Monokatman kültür koşulları altında tespit edilemeyen ancak 3D tipik kültürlerde meydana gelen küresel gen ekspresyon değişikliklerini analiz etmek için akış sitometrisi ile gen ekspresyon mikroarray profillemesinin kombinasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu, özellikle 3D çekirdek kültür Mikroçevresi altında meydana gelen çift yönlü sinyal yolaklarının ayrıntılı analizine olanak sağlayacaktır.