Tümör 4D Canlı hücre Görüntüleme için MAME Modeller: Mikroçevre etkileşimler olduğunu Etki Malign İlerlemesi

Bu prosedürün genel amacı, hücreler arası etkileşimlerin gerçek zamanlı canlı hücre görüntülemesinde kullanılmak üzere, meme mimarisi ve mikroçevre mühendisliği veya MAM olarak adlandırılan 3D ko-kültür modelleri oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle lamel camların fibroblast D söndürülmüş veya DQ kolajen bir ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Kolajen bir matrisi.

Ardından sönümlenmiş DQ kolajen₄ eklenir. Katılaşmış DQ kolajen₁ üzerine, fibroblastlar gömülü olan kolajen₁ matriksi ile birlikte rekonstitüe bazal membran matriksi eklenir. Üçüncü adımda, epitel veya tümör hücresi süspansiyonu lamellerin üzerine katmanlar halinde eklenerek hücrelerin DQ kolajen₄ rekonstitüe bazal membran matriksine tutunması sağlanır ve ardından besiyeri eklenir.

Son olarak, canlı meme kanseri ko-kültürlerinin üç uzamsal boyutuna ek olarak zaman boyutunu da analiz eden dört boyutlu (4D) görüntüleme gerçekleştirmek için konfokal mikroskopi kullanılır. Nihayetinde 4D görüntüleme, meme tümör hücreleri ile tümör mikroçevresindeki diğer hücreler arasındaki ve invaziv bir fenotipe ilerlemeyi etkileyebilecek dinamik etkileşimlerin görselleştirilmesine ve analizine olanak tanır. Bu tekniğin intravital görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, modelimizde gözlemlenen etkileşimlerin, örneğin insan tümör hücreleri ile fare stromal hücreleri arasında değil, tek bir türe ait hücreler (insan tümör hücreleri ve insan tümörle ilişkili hücreler) arasında gerçekleşmesidir.

Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler zorluk çekecektir çünkü ana çekirdek kültürlerinlemede önce görselleştirme yapılması gerekmektedir ve ardından başarı için orta düzeyde beceri ve pratik gereklidir. Alkolle sterilize edilmiş bir dikdörtgen plastik kapağı yerleştirerek başlayın. 35 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin veya bir IBI tree, 35 milimetrelik mu kap kullanın.

Ardından, istenen sayıdaki fibroblastı DQ kolajen ile karıştırın. Daha sonra, 100 mikrolitrelik bir mikropipet kullanarak, 70 mikrolitre fibroblast DQ kolajenini (bir kolajen bir matris) lamın tüm yüzeyine dikkatlice pipetleyip yayın ve kültür kabını, karbondioksit içermeyen, nemlendirilmiş 37 °C inkübatörde 30 dakika bekletin. Matrisler katılaştıktan sonra, %5 karbondioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde 10 dakika boyunca dengeye gelmesini sağlayın.

Ardından, oda sıcaklığına gelene kadar kabı bir çeker ocak altına yerleştirin. Katılaşmış DQ kolajenin üzerine 60 µL DQ kolajen, dört yeniden oluşturulmuş bazal membran matrisi ve gömülü fibroblastlar içeren bir kolajen 1 matrisi ekleyin. Daha sonra, bir pipet ucu kullanarak, fibroblastları içeren DQ kolajen 1 kolajen 1 matrisini çizmemeye dikkat ederek DQ kolajen dört yeniden oluşturulmuş bazal membran matrisini dikkatlice ve eşit şekilde yayın.

Ardından, DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix katılaşırken, kap ve lamı 10 dakika boyunca %5 karbon dioksit içeren 37 °C'lik inkübatöre aktarın; bu sırada tripsinleyin ve ko-kültür için hücreleri sayın. Şimdi, 50 µL hücre süspansiyonunu kaplanmış lamın üzerine yerleştirin ve hücrelerin DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix'e tutunmasını sağlamak için kabı %5 karbon dioksit içeren 37 °C'lik inkübatörde 40 ila 60 dakika bekletin. Hücreler matrise tutunduktan sonra, 35 mm'lik kaba %2 reconstituted basement membrane içeren 2 mL kültür ortamı ekleyin.

Ardından, PBS ile yıkadıktan sonra görüntüleme öncesinde istenen süre boyunca inkübe edin; ko-kültürleri, MEGM medium içinde 5 µM CellTracker Orange ile 37 °C'de %5 CO2 içeren bir inkübatörde 45 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından ko-kültürleri tekrar PBS ile yıkayın ve 37 °C'de %5 CO2 içeren bir inkübatörde önceden ısıtılmış MEGM medium ile 30 dakika inkübe edin. Ko-kültürleri düşük büyütmede görüntüleyin. Örneğin, konfokal mikroskopta su daldırma objektif ile 10x büyütmede, yapıların tüm derinliği boyunca 10 µm aralıklarla optik kesitler alın.

Velocity yazılımı veya benzeri bir program kullanarak optik kesitlerden görüntülerin 3D rekonstrüksiyonunu gerçekleştirin. Yapıların, hücre-hücre etkileşimlerinin ve çevre matrisle olan etkileşimlerin görselleştirilebilmesi için 3D rekonstrüksiyonların videolarını hazırlayın. Bir ana ko-kültürün bu temsilî şematik diyagramında, bir IBI tedavi mu kabı önce kolajen ile kaplanmış, biri DQ kolajen içeren, diğeri ise burada macenta renginde görüldüğü gibi fibroblastlar içeren bir kaptır.

Ardından, DQ kolajen dört içeren ikinci bir yeniden oluşturulmuş bazal membran tabakası eklendi. Sonrasında, kırmızı ile gösterilen tümör hücreleri üst tarafa ve %2 yeniden oluşturulmuş bazal membran içeren kültüre ekildi.

Krem rengi noktalarla temsil edilen medya, her medya değişiminde eklenmiştir. DQ kolajen bir ve dördün floresan parçalanma ürünleri yeşil ile temsil edilmiştir. Bu temsili MCF 10 DCIS ve WS 12 TI ko-kültürünün 23 günü boyunca, burada ve sonraki şekillerde görüntülenen hücrelerin proliferasyonu (kırmızı), ayrıca burada ve sonraki şekillerde gözlemlenen DQ kolajen dört ve birin degradasyonu (yeşil) ve ko-kültürlerin hacmindeki azalma ile belirtilen kolajen matrislerin yıkımı gerçekleşmiştir.

Aynı canlı ko-kültürler 23 gün boyunca gözlemlenmiş olup ko-kültürün 3, 16 ve 23. günlerinde konfokal mikroskopi ile görüntüler yakalanmıştır. Mame ko-kültürlerindeki etkileşimler dinamiktir ve zamanla değişebilir. Örneğin, ko-kültürün üçüncü günündeki bu 3D hücre mam modelinde görüldüğü üzere, hücreler bu aşamada matrislerde yeni çoğalmaya başlamıştır ve yeşil floresans yokluğunun da kanıtladığı gibi hâlâ oldukça stabildirler.

Buna rağmen, hücreler çoğalmaya devam ettikleri için 16. güne gelindiğinde, burada yeşil renkteki DQ kolajen bir ve dört kesim ürünleri ile gözlemlendiği üzere, matris yapısını yıkmaya da başlamışlardır; ayrıca matris ve hücrelerin birlikte floresan yaydığı sarı renkli bölgelerde, hücrelerin matrisi aktif olarak parçaladığı görülmektedir. Ko-kültür hacminin 110.000 cubic micrometers olduğu üçüncü güne kıyasla, 23. günde matrisin neredeyse yarısı hızla çoğalan hücreler tarafından yıkılmıştır. 16. ile 23. günler arasında hacim, bu gün itibarıyla yalnızca 46.250 cubic micrometers'a düşmüştür.

16 ko-kültüründe, kırmızı renkli DCIS hücrelerinin yüzeyinde DQ kolajen dört proteolizi ve beyaz renkli fibroblastların yakınındaki bölgelerde DQ kolajen birin difüz proteolizi gözlemlenebilir. Bu ko-kültürde kullanılan diferansiyel boyama, gelişim sonrası iki hücre tipinin belirgin migrasyon ve proliferasyon paternlerinin gözlemlenmesine de olanak tanır. Bu teknik, meme kanseri alanındaki araştırmacıların, kanser hücreleri ile çevreleyen stroma hücreleri arasındaki dinamik etkileşimlerin canlı hücre görüntülemesini kullanarak, tümör makroçevresinin kanser progresyonu üzerindeki etkilerini araştırmalarının önünü açmıştır.