İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Bu prosedürün genel amacı, içeri doğru doğrultucu potasyum kanallarının aktivitesini modüle eden yeni bileşikler keşfetmektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen bir KIR kanalını eksprese eden tetrasiklin indüklenebilir HK 2 9 3 hücrelerinin bir 384 kuyucuklu plakaya ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücrelerin flu in two adlı floresan talyum raporlayıcı boya ile yüklenmesidir.

Ardından, hücrelerdeki bağlanmamış boya yıkanır ve yerine taşıyıcı kontrol veya test bileşikleri içeren analiz tamponu eklenir. Son adım, talyum akışını başlatmak için kuyucuklara stimülasyon tamponu eklenmesidir. Son olarak, KIR kanalı üzerinden talyum iyonlarının hareketini değiştiren bileşikleri belirlemek için bir floresan plaka okuyucu kullanılır.Kötü.

Bu yöntemin manuel patch clamp elektrofizyolojisi gibi mevcut tekniklere karşı temel avantajı, araştırmacının aynı anda yüzlerce ve günde binlerce deney gerçekleştirmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, araştırmacının içeriye doğru doğrultucu potasyum kanalı modülatörlerini keşfetmek için binlerce küçük molekül içeren kütüphaneleri taramasına imkan verir. Talyum akışı deneyinden bir gün önce, hücreleri disosiye edin ve beraberindeki makalede açıklandığı şekilde hücre süspansiyonunun yoğunluğunu belirleyin. Ardından, %10 diyalize edilmiş FBS içeren BH ortamı kullanarak, her bir kuyucuğa ilgilenilen bir KIR kanalı geni ile stabil olarak transfekte edilmiş 20.000 monoklonal hücreyi, bir thermo multi drop combi veya çok kanallı pipet yardımıyla BD pure coat Amin kaplı 384 kuyucuklu plakaya ekleyin. Ertesi gün, hücrelerin yapışık olduğundan ve kuyucukların tabanına eşit şekilde dağıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında inceleyin.

Ardından, hücre kültürü ortamını kuyu başına 20 µL HBSS analiz tamponu ile değiştirmek için bir ELX 4 0 5 mikroplaka yıkama cihazı kullanın. Bundan sonra, 50 µg flus in two tozunu 100 µL susuz DMSO içinde çözmek için tüpü kısa bir süre santrifüj ederek 2:00 AM D yükleme solüsyonundaki flusları hazırlayın.

Şimdi boyaya 50 µL %20 ağırlık/hacim onic F1 27 DMSO çözeltisi ekleyin. Nazikçe pipetleyerek karıştırın. Ardından, 35 mL HBSS analiz tamponuna 150 µL flus in 2:00 AM onic F1 27 ekleyin ve nazikçe karıştırın.

Ardından, halihazırda 20 µL HBSS assay.Buffer içeren her bir kuyucuğa 20 µL boya yükleme tamponu ekleyin. Hücreler boya ile yüklenirken hücreleri oda sıcaklığında yaklaşık bir saat inkübe edin. 0,5 g sodyum bikarbonatı 50 mL beş x talyum stimülasyon tamponu içinde taze olarak çözerek bir talyum stimülasyon plakası hazırlayın.

Ardından, çözeltiden 50 µL'yi polipropilen 384 kuyuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa ekleyin. Hücreler flus ile yüklendikten 2:00 saat sonra, plakayı bir ELX 4 0 5 mikroplaka yıkayıcı ile yıkayın. Daha sonra, her kuyucuğa 20 µL veya 40 µL HBSS assay tamponu ekleyin; plaka artık deneyler için hazırdır.

Talyum ve hücre plaklarını, entegre sıvı dağıtım özelliklerine sahip bir Hema Matsu fonksiyonel ilaç tarama sistemi veya eşdeğer bir kinetik görüntüleme plaka okuyucusuna yerleştirin ve flu oh four gibi floresein tabanlı boyalar için uygun filtreleri kullanın. Ardından, 40 µL HBSS analiz tamponu içeren hücre plağının ilgili kuyucuklarına 10 µL 5X Talyum serisi eklemek için tek seferlik bir ekleme protokolü oluşturun. Daha sonra, en az 10 saniye boyunca 1 Hz örnekleme frekansında bazal floresan değerini kaydedin.

Optimal hücre ekimi, yıkama ve yükleme koşulları belirlendikten sonra, plak boyunca kuyucuklar arası floresan değerleri tekdüze ve stabil olmalıdır. Bu sırada, her kuyucuğa talyum uyaran tamponunu aynı anda eklemek için entegre 384 kanallı pipetleyiciyi kullanın ve talyumla indüklenen floresan artışının hızı ve zirve noktası çevrimdışı analiz için kaydedilebilmesi amacıyla kayda en az iki dakika daha devam edin. Deneylerin bir sonraki serisinde, 384 kuyucuklu bir plakanın her sütun ve satırındaki her iki kuyucuktan birine kontrol inhibitörü ekleyerek ve diğer kuyucuklara taşıyıcı kontrol olarak DMSO ekleyerek assay'in tekdüzeliğini ve tekrarlanabilirliğini değerlendirin.

Çok kanallı pipet kullanın. Hedef KIR kanalının önceden belirlenmiş konsantrasyondaki inhibitörünü her kuyuya 80 µL ve %0,1 DMSO taşıyıcı olacak şekilde 384 kuyucuklu polipropilen bir plakaya pipetleyerek bileşik DMSO plağını hazırlayın. Bu işlem, bilinen bir inhibitörün A1 kuyusundan başlanarak B2 kuyusuna ve bu şekilde B24 kuyusuna kadar dönüşümlü olarak eklenmesiyle gerçekleştirilir.

Bu prosedürü, B1 kuyucuğundan başlayarak A24 kuyucuğuna kadar DMSO ile tekrarlayın. Şimdi hücre, bileşik ve talyum stimülasyon plakalarını plaka okuyucuya yerleştirin. Ardından, 20 µL HBSS assay tamponu içeren hücre plağının ilgili kuyucuklarına, 2X konsantrasyondaki bileşik serisinden 20 µL eklemek için bir ekleme protokolü oluşturun.

Bileşikleri hücre plağına ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakikaya kadar inkübe edin. İki floresan için bazal akışları en az 10 saniye boyunca kaydedin. Ardından, hücre plağının her kuyucuğuna 10 µL beş katlı talyum tamponu ekleyin.

Sonuçların tekrarlanabilirliğini belirlemek için deneyi art arda üç gün boyunca tekrarlayın. Z prime değerini hesaplamak için DMSO içindeki talyum akışını ve ilaçla işlem görmüş hücreleri kullanın. İki kuyu popülasyonu arasındaki kuyudan kuyuya değişkenliğin istatistiksel bir ölçüsü olan Z prime değerini, P'nin inhibe edilmemiş akış değeri ve N'nin tam inhibe edilmiş akış değeri olduğu varsayılarak, P ve N'nin ortalamaları ile standart sapmalarına dayanan şu formül kullanılarak hesaplayın.

Üç ayrı günde ZPrime değerleri 0,5'e eşit veya 0,5'ten büyük olan bir analiz, yüksek kapasiteli tarama için uygun kabul edilir. Bu şekiller, farklı deney türlerinde kullanılan hücre ekim haritalarına bazı örneklerdir. İndüklenmemiş veya tetrasiklin ile indüklenmiş hücreler içeren kuyucukların konumları farklı renklerle belirtilmiştir.

Bu şekil, analiz geliştirme ve bileşik taraması için optimal talyum konsantrasyonunu belirlemek amacıyla kullanılan kaynak plaka haritasını göstermektedir. Renk gradyanı, %100'den %0,002 talyuma kadar uzanan üç katlı dilüsyon serisini temsil eder ve burada, düşükten yükseğe talyum akı değerlerini belirten, soğuktan sıcağa renklerle gösterilen temsili bir floresans yoğunluk haritası yer almaktadır. Talyum CRC'ye dört parametreli lojistik fonksiyonun uydurulduğu burada gösterilen hücre ekim haritası, %15 talyum olan bir EEC 80 değerini belirlemek için kullanılır.

Bu şekil, bir deneyin DMSO toleransını belirlemek için kullanılan kaynak plaka haritasını göstermektedir. Birinci ve 24. sütunlar yalnızca deney tamponu içerirken, renk gradyanı %10'dan 0,01% DMSO'ya kadar uzanan iki katlı dilüsyon serisini belirtmektedir; burada düşük talyum akı değerlerinin daha koyu mavi ile gösterildiği temsili bir floresan yoğunluk haritası yer almaktadır. Belirtilen DMSO konsantrasyonlarını içeren kuyucuklardan kaydedilen ortalama talyum akı değerleri burada özetlenmiştir.

Şu anki şekil, bir KIR kanalının bilinen inhibitörleri için konsantrasyon yanıt eğrileri oluşturmak amacıyla kullanılan kaynak plaka haritasını göstermektedir. Her bileşik farklı bir renkle belirtilmiştir ve tipik olarak üç katlı dilüsyon serisi şeklinde plakalanmıştır. Burada temsili bir floresan yoğunluk haritası gösterilmekte olup, bu şekil, geliştirme ve optimizasyon sonrası inhibitör tarafından talyum akışının doza bağlı inhibisyonunu göstermektedir.

Talyum akımı analizi, çeşitli rutin farmakoloji analizlerini gerçekleştirmek için de kullanılabilir. Talyum akımı analizi daha önce voltaj ve ligasyon bağımlı potasyum kanalları, seçici olmayan katyon kanalları ve hatta potasyum taşıyıcıları ile kullanım için uyarlanmıştır. Talyum ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedür uygulanırken eldiven kullanımı ve uygun atık bertarafı gibi önlemler her zaman alınmalıdır.