Embriyolar yılında Programlı Hücre Ölümü Algılama LysoTracker kullanımı ve Embriyonik Kök Hücreler Farklılaşan

Aşağıdaki prosedürün amacı, hücre ölümü modellerini tespit etmek için fare embriyoları ve farklılaşmış kök hücrelerden oluşan iki tip örneğin lizozomlarının lyo tracker boyası ile nasıl sürdürüleceğini göstermektir. Embriyo örneklerini hazırlamak için, embriyolar önce cerrahi olarak izole edilir ve farklılaşmış hücreleri hazırlamak üzere bir kaba yerleştirilir. Embriyo gövdelerini oluşturmak için embriyonik kök hücreler kullanılır.

Bu embriyo gövdeleri süspansiyon içinde kültüre edilir ve ardından bir chamber slide üzerinde monokatman olarak büyütülür. Tüm embriyolar monokatman halindeyken LysoTracker Red ile inkübe edilebilir, ardından durulanabilir ve fikse edilebilir; daha sonra LysoTracker boyanma sonuçlarını incelemek ve nicelleştirmek için örneklerin fotoğrafları çekilebilir. Boyama, embriyolardaki ve kültüre edilmiş hücrelerdeki programlı hücre ölümünü analiz etmek için kullanılabilecek basit bir prosedürdür.

Bu tekniğin tünel analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, OT takip boyasının küçük bir molekül olması nedeniyle kalın dokuların hızlı ve kolay bir şekilde analiz edilebilmesidir. Bu yöntem, fare embriyolarındaki ve diferansiye kültürlerdeki programlı hücre ölümü paternleri hakkında içgörü sağlayabilmenin yanı sıra tavuk embriyoları ve diferansiyasyon halindeki yetişkin kök hücreler gibi diğer doku türlerine de uygulanabilir. Genç dişi fareleri bir erkek damızlıkla eşleştirin ve takip eden sabahlar, çiftleşmenin gerçekleştiğini gösteren vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin.

Vajinal tıkanın görüldüğü günün öğle vakti, etkili olarak 0,5 gün olarak kabul edilir. İlgilenilen embriyonik günde, koit sonrası dişiyi onaylanmış protokollere göre sakrifiye edin ve uterusu Hank's BSS içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına alarak kanı durulama yoluyla temizleyin. Embriyoları birbirinden ayırın ve uterustan çıkarın.

Ekstra embriyonik membranları uzaklaştırın ve yabancı dokuları ve kanı temizlemek için Hank's BSS ile en az bir kez durulama yapın. Temizleme işlemi sırasında diseke edilen embriyoları buz üzerinde tutun. Diğerlerini.

Beş mililitre Liso tracker embriyo boyama çözeltisi hazırlayın. Bu miktar, bir veya iki embriyo toplama işlemi için yeterli bir hacimdir. Boyayı eşit şekilde dağıtmak için çözeltiyi nazikçe karıştırın, ardından embriyoları çözeltiye aktarın ve 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından embriyoları, her yıkama beş dakika sürecek şekilde, Hank's BSS ile dört kez nazikçe durulayın. Dokulara zarar vermemek için durulama işlemini nazikçe yapmak önemlidir. Hassas embriyoların konumuna dikkat ederek ve onları her zaman örten bir miktar sıvıyı geride bırakarak sıvıyı yavaşça uzaklaştırın.

Ardından embriyoları, ertesi gün gece boyunca %4 paraformaldehit ile fikse edin. Fiksatörü uzaklaştırmak için embriyoları Hank's BSS ile 10 dakika boyunca bir kez durulayın. Şimdi, arka plan boyanmasını ortadan kaldırmak için dokuları bir metanol serisi aracılığıyla dehidrate edin.

Bu adım, saklama öncesindeki görüntüleme sırasında sinyal-gürültü oranını iyileştirir. Gerekiyorsa, genetik analiz için her embriyodan bir doku örneği toplayın. Daha sonra, genotipleme öncesinde doku örneğini yeniden hidrate edin.

Embriyoları, doku örneğiyle eşleşen etiketlerin bulunduğu ayrı tüplere ayırın. Artık izole edilen embriyolar, eksi 20 °C sıcaklıktaki metanol içerisinde süresiz olarak saklanabilir. Işıktan koruyunuz.

Asılı damla yöntemiyle embriyo gövdelerini hazırlayarak başlayın. Üç gün sonra, damla başına 20 µL'de 500 hücre başlangıç yoğunluğuyla, embriyo gövdelerini 10 cm'lik yapışmaz Petri kaplarındaki süspansiyon kültürlerine aktarın. Beş gün boyunca kültüre edin ve beşinci günden sonra her iki günde bir medyayı değiştirin.

Embriyo gövdelerini, her bir bölmeye bir veya iki embriyo gövdesi gelecek şekilde jelatinize edilmiş sekiz bölmeli lamlara aktarın. Embriyo gövdelerini 10 gün daha kültüre edin. 10 gün sonra gün aşırı ortamı değiştirerek, mevcut ortamı nazikçe aspire edin ve her bir bölmeye 300 µL Lyo tracker hücre boyama çözeltisi ekleyin.

Pipet ucunu odacığın köşesine yerleştirerek medyumu manuel olarak çekmeye dikkat edin. Bu sayede, hala cam yüzeye tutunmakta olan gövdeleri yanlışlıkla kaldırmazsınız. Medyumu tekrar eklerken, pipet ucunu odacığın köşesine yerleştirin ve medyumu çok yavaş bir şekilde geri ekleyin.

Odacıkları 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Ardından, her yıkama için beş dakika olacak şekilde DPBS ile iki kez durulayın. Şimdi hücreleri, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraldehit ile fikse edin.

Ardından fiksatifi, beşer dakikalık iki durulama ile DPBS kullanarak uzaklaştırın. Embriyoları monte etmek için, onları derin çukurlu bir cam lama veya küçük bir Petri kabı içine yerleştirin. DPBS'yi aspire ederek hücre örneklerini mikroskopiye hazırlayın.

Hazneyi lamdan çıkarın ve yaklaşık beş dakika boyunca havada kurumaya bırakın. Floroforu korumak için alüminyum folyo ile örtün. Ardından, DAPI içeren Vector Shield gibi sulu bir kapatma medyumu ekleyin ve üzerine bir kapatma lamı yerleştirin.

Artık lam monte edildi ve görüntüleme için hazırdır. Numuneleri; rod, domine veya Texas red filtresi ile donatılmış bir stereo veya bileşik mikroskop ile görüntüleyin. Boyama genellikle oldukça parlaktır, bu nedenle manuel modda uzun pozlama sürelerine genellikle gerek duyulmaz.

Tüm örneklerin dijital fotoğraflarını aynı pozlama koşulları altında çekin. Görüntüleri nicelleştirmek için bunları Adobe Photoshop veya benzer bir görüntüleme programında açın. Lyo tracker boyanma miktarını belirlemek için kırmızı kanalı seçin.

Histogram fonksiyonu tarafından ortaya çıkarılan tüm görüntünün piksel sayısını not edin. Ardından, kırmızı boyamanın artık beyaz piksellerle temsil edileceği şekilde görüntüyü eşikleyin. Bu işlem görüntüyü siyah beyaza dönüştürür.

Bir eşik değeri belirleyin ve bu değeri settteki tüm görüntüler için kullanın. Renk aralığı aracını kullanarak beyaz pikselleri seçin ve toplam beyaz piksel sayısını elde etmek için histogram fonksiyonunu kullanın. Alandaki çekirdek sayısını saymak için mavi kanalı kullanın.

Görüntüye notlar ekleyerek sayımın kaydını tutmak, değerleri kaydetmek ve bunları hücre başına ortalama boyama düzeyini hesaplamak için kullanmak faydalı olabilir. Bu analizi, geri kalan tüm görüntüler için aynı eşik ayarıyla tekrarlayın. Örnekleme amacıyla, sonic hedgehog mutant embriyolarını boyamak için ly o tracker kullanılmıştır.

ly O izleyici küçük ve oldukça difüze olabilen bir molekül olduğu için, kopülasyon sonrası 10,5. günde boyanan tüm embriyoların derin bölgelerinde programlı hücre ölümü veya PCD, özellikle ekstremite ve somit bölgelerinde sonic hedgehog null mutant embriyolarında büyük ölçüde artış göstermiştir. Genel örüntüyü değerlendirmek amacıyla ekstremite tomurcukları, bütün mountlar halinde daha yüksek büyütmede görüntülenmiştir. Diseke edilen kısımlar ayrıca titreşimli mikrotom ile kesitlenmiştir.

Ok başı, kriyostat ile elde edilen kesitlerde sonic hedgehog null distal ucundaki artmış TUNEL boyanmasını göstermektedir; bu kesitlerde TUNEL boyanması OT Tracker ile birlikte kullanılmıştır. LysoTracker ve TUNEL boyanması arasında kesin bir birebir korelasyon olmasa da, PCD'nin genel bölgeleri yüksek büyütme altında önemli ölçüde örtüşmektedir. Sadece TUNEL testi ile pozitif boyanan hücrelerin, sadece LysoTracker ile boyanan hücrelerin ve örtüşen boyanmaya sahip hücrelerin görülebildiği anlaşılmaktadır. 10 günlük embriyo gövde kültürünün ardından hücreler; nöronlar, kas hücreleri ve kardiyomiyositler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine farklılaşmıştır.

Diferansiye ES hücrelerinin normal kültüründe, lyo tracker ve tunnel analizleri ile tespit edildiği üzere, PCD geçiren birkaç hücre bulunmaktadır. Ardından, oksidatif stres kaynaklı hücre ölümünü indüklemek için hücreler hidrojen peroksit ile işleme tabi tutulmuştur. Düşük doz hidrojen peroksit, işlem uygulanmayan grupla karşılaştırıldığında hem lyo tracker hem de tunnel boyanmasını artırmıştır.

Embriyodaki sonuçlara benzer şekilde, her iki boyama da ortak ve özgün hücreleri işaretlemiştir. Yüksek doz hidrojen peroksit, hücre büzülmesine ve daha yaygın OT izleyici ve tunnel pozitifliğine yol açmıştır. Karşılaştırma amacıyla, bir saatlik serum açlığının ardından otofajiyi indüklemek için serum açlığı uygulanmıştır.

OT izleyici boyanması artmıştır. Ancak, TUNEL pozitifliği normal seviyelerde kalmıştır. Bu nedenle, reer kolay ve kullanışlı olsa da, örnekler nicelleştirildikten sonra boyanmanın apoptozu mu yoksa otofajiyi mi temsil ettiğini belirlemek için ek analizlerle takip yapmak önemlidir.

Daha önce gösterilen basit Photoshop yöntemi kullanıldığında, sonuçlar hidrojen peroksit konsantrasyonunun artmasının daha yüksek düzeyde lys tracker boyanmasıyla sonuçlandığını doğrulamıştır. Bir kez uzmanlaşıldığında, bu boyama prosedürü doğru şekilde uygulandığı takdirde iki saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, hücre ölümü tipini doğrulamak için NX in five veya lc three immünoboyama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Şu an için Trecker green'in yalnızca canlı hücrelerde çalıştığını, bu nedenle fiksasyon gerektiren örnekler için en iyi seçeneğinizin Reca red olduğunu unutmayın.