Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Bu prosedürün genel amacı, taze olarak ayrıştırılmış mezenterik arter düz kas hücrelerindeki KV seven potasyum kanallarının aktivitesini ölçmek ve bunu fizyolojik koşullar altında kaydedilen arter çapı ölçümleriyle ilişkilendirmektir. Bu işlem, öncelikle bir sıradan mezenterik vasküler arkadın cerrahi olarak çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise mezenterik arter segmentlerinin diseke edilmesi ve temizlenmesidir.

Ardından, KV7 potasyum akımlarının patch clamp elektrofizyolojik ölçümlerini yapmak üzere tekil düz kas hücrelerini izole etmek için bazı segmentler kullanılır. Son adım, KV7 potasyum kanallarının farmakolojik modülatörlerine yanıt olarak gelişen arteriyel konstriksiyon veya dilatasyonun basınç miyografisi ölçümleri için sağlam arteriyel segmentlerin kanülasyonudur. Nihayetinde, patch clamp elektrofizyolojisi ve basınç miyografisinin kombinasyonu, KV7 potasyum kanallarının aktivitesindeki artış veya azalışın mezenterik arteriyel konstriksiyonu nasıl etkilediğini göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin, hücre hatlarında eksprese edilen klon kanalların kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, akımların kanalları doğal olarak eksprese eden kültürlenmemiş hücrelerden kaydedilmesi ve KV akımlarının aynı hücrelerde aktive olabilecek diğer potasyum kanalı sınıflarından izole edilebilmesidir. Basınç miyografisi, fonksiyonel yanıtların izole hücrelerin elde edildiği aynı dokudan kaydedilmesine olanak tanır ve bu yöntem, arteriyel halkalar veya arteriyel şeritler gibi diğer preparasyonlara göre hem daha hassas hem de daha fizyolojik bir yöntemdir. Laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Bareth Mani, arteriyel kanülasyon ve basınç miyografisi tekniklerini; laboratuvarımdaki araştırma görevlisi profesör Dr. Luba Brueggeman ise hücre izolasyonu ve patch-clamp prosedürlerini uygulamalı olarak gösterecektir.

Bu prosedüre başlamak için, bir çift cerrahi makas kullanarak bir sıçanın ince bağırsağının her iki ucundan 10 ila 12 santimetrelik bir segment kesin. Ardından, bağırsağı bağlı olduğu damar yapısıyla birlikte izole edin. Sonrasında, ince bağırsak segmentini iğnelerle sabitleyin.

Mezenteri, superior mezenterik arterin primer dalı merkezde kalacak ve sonraki sıra dallar merkezden dışarıya doğru yayılacak şekilde haznenin yakın tarafına yayın. Ardından, aydınlatmalı bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyerek pinleri yalnızca intestinal segmentlerin üzerine yerleştirin. Mikro pens ve makas kullanarak, bağırsaklara yakın olan ikinci ila dördüncü sıra arterlerin etrafındaki adipoz dokuyu ve bağ dokusunu dikkatlice temizleyin.

Adipoz doku ve bağ dokusunun temizlenmesini kolaylaştırmak ve arterlerin gereksiz yere gerilmesini önlemek için bitişik venleri tutun. Şimdi, mezenterik arterden iki ila üç segmenti, iki mililitre buz soğukluğunda izolasyon solüsyonu içeren 35 milimetrelik bir doku kültürü kabına aktarın. Ardından kabı buz üzerine yerleştirin ve mezenterik arter segmentlerini, ucu ateşle cilalanmış bir PEs pipeti kullanarak üç ila dört milimetre uzunluğunda parçalara bölün.

Arter segmentlerini, 37 °C'de ön ısıtılmış iki mililitre izolasyon çözeltisi içeren cam bir viyale aktarın. Ardından, 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra, 37 °C'deki izolasyon çözeltisini bir pastör pipeti ile dikkatlice aspire edin.

Buna iki mililitre ılık enzim solüsyonu ekleyin, ardından 37 °C'de 35 dakika boyunca inkübe edin. Enzim solüsyonundaki 35 dakikalık inkübasyonun hemen ardından, tüpü buza yerleştirin, enzim solüsyonunu aspire edin ve iki mililitre buz soğukluğunda izolasyon solüsyonu ekleyin. Bu prosedürü dört kez tekrarlayın.

Ardından, bir mililitre buz gibi soğuk izolasyon solüsyonu içerisinde, arter segmentlerini cilalanmış posterior pipet ile nazikçe 10 ila 20 kez tekrarlanan hareketlerle dağıtarak tekil mezenterik arter düz kas hücrelerini serbest bırakın. Hücre süspansiyonundan bir damlayı 35 milimetrelik bir kaba damlatıp mikroskop altında inceleyerek miyositlerin görünümünü periyodik olarak doğrulayın.

Sağlıklı MA SMC'ler düzgün ve uzamış bir görünüme sahip olmalıdır. Ardından, cilalı bir pastier pipet kullanarak yaklaşık 100 ila 200 µL hücre süspansiyonunu kayıt odasına aktarın ve hücrelerin 15 dakika boyunca yapışmasını sağlayın. Bu adımda, patch pipetinin ucunu amfoterisin B içermeyen iç solüsyona daldırarak ucunu doldurun.

Ardından, bir boru parçasıyla bağlanan 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak diğer uçtan vakum uygulayın ve üstten pipet solüsyonu içeren info terin B ekleyin. Pipet yaklaşık yarıya kadar solüsyonla dolana kadar bir einor mikro yükleyici pipet ucu kullanın. Pipete hafifçe vurarak hava kabarcıklarını giderin.

Ardından, pipeti elektrot tutucuya yerleştirin. Pipeti uzamış bir miyositin yüzeyine indirmek için bir mikromanipülatör kullanın. Pipet direnci 6 ila 10 mega ohm seviyesine çıktığında, giga seal oluşturmak için vakum uygulayın.

Aynı zamanda, membran perforasyonunu beklerken tutma voltajını sıfır milivolt olarak ayarlayın. Ardından, sırasıyla artı 10 milivolt ve eksi 10 milivolta 100 milisaniyelik voltaj adımları uygulayın. Tüm hücre kapasitansının ortaya çıkışıyla eş zamanlı olarak meydana gelen hızlı pipet kapasitans geçişini kompanse etmek için amplifikatörü kullanın.

2 ila 10 pA değerindeki geçici, küçük ve sürdürülebilir pozitif akımlar, KV seven kanallarının fonksiyonel olduğunu gösterir. Amfoterisin B ile başarılı perforasyon, erişim direncini 35 MΩ veya daha altına düşürecektir. KV seven akım-voltaj ilişkisini kaydetmek için, KV seven kanallarının açık olma olasılığının minimum olduğu -84 mV'den, açık olma olasılığının bir platoya ulaştığı +16 mV'ye kadar değişen voltaj basamaklarını beşer saniye boyunca uygulayın. Her test voltajında beş saniye bekledikten sonra, -4 mV tutma voltajına 10 saniye boyunca geri dönün.

Bu prosedürde, her iki tarafa önceden hazırlanmış iki ince naylon sütur gevşekçe yerleştirilir. Mikro pens yardımıyla segmentin bir ucu tutularak, diseke edilmiş mezenterik arter segmenti cam kanülün yanına, diseksiyon haznesinden basınçlı miyogreft haznesine dikkatlice aktarılır. Ardından, aydınlatmalı bir diseksiyon mikroskobu altında görüntüleme yaparak arter segmentinin bir ucu tutulur ve nazikçe sol cam kanülün üzerine kaydırılır.

Naylon sütürleri kullanarak ucu sabitleyin. Ardından, kanı ve kalıntıları temizlemek için monte edilmiş damarın lümeninden nazikçe sıvı akıtın. Sol şırınganın vanası kapatılmalıdır; böylece bu taraf, sağ taraftan ayarlanan basınca karşı statik bir sıvı sütunu oluşturacaktır. Mikro manipülatörü kullanarak hareketli sağ cam kanülü arter segmentine yaklaştırın ve segmentin sağ ucunu kanülün üzerine çekin.

Son olarak, arter segmentini naylon sütürlerle sabitleyin ve fazla sütür iplerini kesin. Şimdi basınç grafiği ünitesini, basınç mikrograf mikroskobunun üzerindeki sahneye yerleştirin. Basınç kolonunu grafik haznesinin sağ tarafına bağlayın ve ardından kapağı haznenin üzerine yerleştirin.

10 mililitrelik şırıngayı 15 dakikalık bir süre boyunca kademeli olarak yükseltin ve P1 basınç dönüştürücüsü 80 milimetre civa değerini okuyana kadar damarda herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin; gerektiğinde kanül arasındaki mesafeyi ayarlayın; mesafe, basınçlandırılmış arter segmentinin yaklaşık olarak düz olması ve bağların yapıldığı yerlerde omuz benzeri bir yapı oluşturması şeklinde ayarlanmalıdır. Monte edilen damarın canlılığını, 30 saniye boyunca 60 milimolar potasyum klorür ile geçici süperfüzyon uygulayarak kontrol edin. Canlı bir damar, potasyum klorür eklenmesiyle hızla büzülür ve yıkanmasıyla hemen genişler.

Ardından, konsantre test maddesini banyo çözeltisine ekleyin; test maddesini banyo çözeltisiyle karıştırmak ve 10 mililitrelik haznede uygun nihai konsantrasyonu elde etmek için haznenin sonu yakınında pipetle nazikçe ileri geri çekip itin. Test maddesinin eklenmesinin ardından kap çaprındaki hacim değişiklikleri, canlı video görüntüsünden izlenebilir ve deney devam ederken görüntü analiz penceresinde grafikleştirilebilir. Bu şekil, tek bir mezenterik arter miyositinde, siyahla gösterilen tedavi öncesi ve 100 nanomolar çinko perion varlığında stabilizasyon sonrası kırmızıyla gösterilen voltaj basamaklarına yanıt olarak kaydedilen bir dizi ardışık akım izini göstermektedir; burada kontrol grubu ve 100 nanomolar çinko perion için temsilci akımlar yer almaktadır.

Gri çubuklar, ortalama akım genliklerinin ölçüldüğü zaman aralığını göstermektedir. Akım-voltaj grafikleri için basamak voltajları sağ tarafta ok uçlarıyla belirtilmiştir. Burada, -20 mV sürekli voltaj klempi ile ölçülen 100 nM çinko perion tarafından tetiklenen KV7 akım artışının zaman seyri gösterilmektedir. Aşağıda, 100 nM çinko perion tedavisi öncesinde, tedavi sırasında ve 10 µM KV7 kanal blokeri XC 9 9 1 tedavisi sırasında kaydedilen KV7 akım yoğunluklarından türetilen ortalama akım-voltaj eğrileri yer almaktadır; 100 pM arjinin vazopressin ile önceden daraltılmış mezenterik arterin çinko iyonu kaynaklı gevşemesi gösterilmiştir.

Bu şekil, 100 picomolar arginine vazopressin uygulamasını ve ardından 100 nanomolar çinko iyonu uygulamasını takiben damarın dış çapındaki değişimlerin zaman seyrini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, tek hücre izolasyonu veya arteriyel konstriksiyon ve dilatör yanıtların basınç miyografik ölçümü için arterlerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir bilgiye sahip olmalısınız. Ayrıca, taze izole edilmiş arteriyel miyositlerde KV seven akımlarının diğer akımlardan bağımsız olarak nasıl kaydedileceğini bilmelisiniz.