SeqA-DNA kompleksleri kristalleşmesi için DNA dupleksler optimizasyonu İteratif

Bu deney, tandem şeklinde hemi-metillenmiş GATC içeren bir DNA'ya bağlı bir proteinin difraksiyon kalitesindeki kristallerinin nasıl elde edileceğini detaylandırmaktadır. Protein DNA kompleksinin kristal paketlemesini iyileştirmek için işlemi tekrarlayın. DNA uzunluğunun, GATC aralıklarının ve DNA uçlarının rasyonel tasarımıyla başlayın; DNA'yı saflaştırmak için tamamlayıcı tek zincirli oligonükleotidlerle devam edin ve ardından hemi-metillenmiş DNA dupleksini oluşturmak için tavlama işlemini gerçekleştirin, sonrasında kompleksi oluşturmak için saflaştırılmış seq A ile karıştırın.

Ardından, ticari seyrek matris tarama kitleri kullanılarak yapılan kristalizasyon denemeleri ile protein-DNA kompleksinin difraksiyon kalitesinde kristallerini büyütmek için optimal koşulları belirleyin. Gösterilen sonuçlar. DNA uzunluğundaki, GATC aralığındaki ve uçlardaki varyasyonların CQ A DNA kristallerinin difraksiyon kalitesi üzerindeki etkisini paylaşın.

Bu çalışmanın amacı, DNA'ya bağlanmış CK'nın difraksiyon kalitesindeki kristallerini elde etmektir; ancak bu çalışma aynı zamanda, diğer protein-DNA komplekslerinin kristalleştirilmesi için DNA dupleksleri tasarlanırken dikkate alınması gereken genel değişkenlerin anlaşılmasına da yardımcı olabilir. Bu prosedürün gösterimi, laboratuvarımdaki doktora bursiyeri Chang, A tarafından kullanılacaktır. Bu çalışmada, DNA replikasyon düzenleyici proteinlerinin bir varyantı kullanılmaktadır. Bu varyant, stabil dimerler oluşturan ve oligomerizasyon ile DNA bağlama domenleri arasında kısaltılmış bir linker bölgesine sahip olan bir formdur.

Bu varyant, DNA bağlanmasını yalnızca DNA üzerinde tek bir kıvrımla ayrılmış tandem GATC tekrarlarıyla sınırlandırır; önce T7 promotörü kontrolü altındaki DEMETRIC seq A'yı kodlayan plazmid ile BBL 20 1D üç hücrelerini transforme edin. Transformasyon reaksiyonunu, mililitre başına 100 mikrogram ampisilin içeren LB agar plaklarına ekin ve bakteriyel inkübatörde gece boyunca bekletin. Karışık kolonileri seçin ve küçük ölçekli bir gece kültürü başlatın.

Ertesi sabah, bir litre kültürü 10 mililitre gece boyu inkübe edilmiş inokulum ile ekimleyin. Kültür log fazına ulaştığında, protein üretimini indüklemek için iki mililitre 0.5 molar IPTG ekleyin. İnkübasyona 37 °C'lik orbital çalkalayıcıda üç saat boyunca devam edin.

Ardından hücreleri 3.300 G'de 10 dakika santrifüj ederek toplayın. Hücre peletini saflaştırma tamponu A'sı içerisinde sonikasyonla süspanse edin ve lizatı 39.000 ×g'de 40 dakika santrifüj ederek berraklaştırın. Şimdi S süpernatantını, saflaştırma tamponu ile dengelenmiş bir heparin kolonuna yükleyin.

CK proteinini elüe etmek için, 1 molar sodyum klorüre doğru lineer bir gradyan kullanın; CK proteini yaklaşık 0,7 molar sodyum klorürde elüe olur. CK içeren fraksiyonları toplayın ve örneğin iyonik gücünü düşürmek için seyreltin.

Ardından örneği, saflaştırma tamponu ile dengelenmiş bir katyon değişim kromatografi kolonuna yükleyin. Yaklaşık 0,4 molar sodyum klorürde saf CK proteinini elüye etmek için lineer bir tuz gradyanı uygulayın. CK içeren fraksiyonları birleştirin.

Mililitre başına üç miligram olacak şekilde konsantre edin ve saklama koşullarında muhafaza edin. Tamamlayıcı metillenmemiş ve metillenmiş oligonükleotidler için tampon tasarımı yapın. Liyofilize tek zincirli DNA'nın her birinden bir mikromol içeren örnekleri 800 mikrolitre otoklavlanmış, çift distile su içerisinde hazırlayın, vorteksleyin ve 15 dakika boyunca bekletin; ardından 800 mikrolitre ekleyin.

20 ila 30 nükleotid uzunluğundaki oligonükleotidler için, her örneğe önceden ısıtılmış iki kat yükleme tamponu ekleyin ve büyük bir %10 denatüre jel hazırlayın. Polimerizasyon tamamlandığında, tarağı çıkarın ve kuyucukları iyice durulayın. Üst ve alt rezervuarları bir kat TBE çalışma tamponu ile doldurarak jeli düzeneğe yerleştirin.

Jeli 55 °C'ye ısıtmak için 750 volt ile ön çalıştırma yapın. Ardından çalıştırmayı durdurun ve kuyucukları çalışma tamponu ile iyice durulayın. Şimdi oligonükleotidleri iki dakika boyunca 90 °C'ye ısıtın.

Vorteksleyin ve santrifüjleyin. Numuneler vakit kaybetmeden jele yüklenir. Oligonükleotid göç edene kadar jeli yaklaşık 700 volt değerinde çalıştırın.

%10'luk poliakrilamid jel üzerinde, alf fenol mavisi yaklaşık 20 baz uzunluğundaki oligonükleotidlerle ve ksilen sülf mavi yaklaşık 60 baz uzunluğundaki oligonükleotidlerle birlikte göç eder. Jeli cihazdan sökün ve ara parçaları düz bir yüzey üzerinde çıkarın. Bir cam plakayı kaldırın ve jeli streç filmle kapatın.

Ardından jeli ters çevirin, diğer cam plakayı çıkarın ve jelin üzerini streç filmle kapatın. Sonra, jelin arkasına yerleştirilmiş floresan bir plaka ve UV ışığı kullanarak bantları işaretleyin. DNA gölgesini bir jilet yardımıyla görebilmek için bandı kesin ve küçük parçalara ayırın.

Her bir örneği steril 15 milliliter tüpe aktarın. Dokuz milliliter elüsyon tamponu ekleyin ve 37 degrees Celsius sıcaklıkta, ajitasyon ile gece boyunca seyreltin. Çözeltiyi, bir jel yükleme pipet ucu kullanarak dikkatlice bir otoklav santrifüj tüpüne aktarın.

Akrilamid parçalarının taşınmasını önlemek için, bir mililitre pH yedi değerinde 3 M sodyum asetat ile 25 mililitre soğutulmuş %100 etanol ekleyin ve en az üç saat boyunca -20 °C'de inkübe edin. Çöktürülen DNA'yı santrifüjleyin. Ardından peletleri speed vac cihazında orta ısıda kurutun; her bir peleti 400 µL otoklavlanmış çift distile su içerisinde yeniden süspande edin ve taze bir tüpe aktarın.

pH 7'de 3 M sodyum asetatın 40 µL'sini ve %100 etanolün 1 mL'sini ekleyin, vorteksleyin ve -20 °C'de 30 dakika inkübe edin; ardından 18.000 ×g'de 15 dakika santrifüjleyin. Kalıntı tuzları uzaklaştırmak için DNA peletlerini 100 µL %70 soğuk etanol ile yıkayın, 18.000 ×g'de 6 dakika santrifüjleyin; ardından etanolü dökün ve peleti speed vac cihazında kurutun.

Şimdi her bir peleti 100 µL otoklavlanmış çift distile su içerisinde yeniden süspande edin. Oligonükleotidlerin konsantrasyonunu spektrometri ile belirleyin. Hemi-metillenmiş DNA duplekslerini hazırlamak için öncelikle tamamlayıcı tek zincirlerin eşit molar konsantrasyonlarını karıştırın.

Ardından, zincirleri denatüre etmek için karışımları bir su banyosunda beş dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın. Örneklerin su banyosunun içinde yavaşça oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Eş hacimlerde 81 µM saflaştırılmış CQ a proteini ve 81 µM hemimetillenmiş DNA'yı birleştirin.

Ardından 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. Ticari seyrek matris tarama setleri kullanılarak kristalleşme koşulları belirlenene kadar 4 °C'de saklayın. İlk kristalleşme ipuçları tanımlandıktan sonra, difraksiyon kalitesinde kristaller büyütmek için koşulları optimize edin. Elde edilen CK DNA kristallerini kriyokorumaya alın.

Kristalizasyon çözeltisindeki PEG 400 miktarını %25 son konsantrasyona çıkarın veya kristalizasyon çözeltisine %20 gliserol ekleyin. Münferit kristalleri naylon loop flash ile alın. Örnekleri sıvı azot içerisinde dondurun.

Şimdi her bir kristalin difraksiyon limitini 100 k'de test edin. Hemi-metillenmiş DNA'ya bağlı CK'nın kısaltılmış mutantının kristal yapısını elde etmek için, DNA üzerindeki üç parametreyi sırasıyla optimize ediyoruz: Hemi-metillenmiş GATC dizileri arasındaki mesafe, dupleks uzunluğu ve beş prime çıkıntıların varlığı veya yokluğu. Bu çalışma, uç terminal domainde daha fazla ligasyonun önüne geçen bir nokta mutasyona ve DNA bağlanmasını tandemle sınırlayan kısaltılmış bir bağlayıcıya sahip bir DME seek a varyantı kullanmaktadır.

DNA elektromobilite kayması analizlerinde GATC tekrarlarının yalnızca bir sarmal dönüşü ile ayrıldığı durumlar, modifiye CK proteininin tercihen dokuz ila 10 baz çifti ile ayrılmış GATC tekrarlarına bağlandığını göstermektedir. Bu nedenle, başlangıç taramalarında, dokuz veya 10 baz çifti ile ayrılmış iki hemi-metillenmiş GATC tekrarı içeren, 23 ila 24 baz çifti uzunluğundaki dupleksler kullanılmaktadır.

Üç dupleks, düzgün şekilli kristaller vermiştir. Kristallerin hiçbiri yüksek çözünürlükte kırınım göstermemiş olsa da elde edilen veriler, kristalleşme için dokuz baz çiftlik A-G-A-T-C ayrımının tercih edildiğini göstermiştir; iki GATC bölgesi arasına bir CG dinükleotid ekleyerek oluk-iskelet etkileşimlerini beklenmedik şekilde artırmak, kristallerin kırınım sınırını değiştirmemiştir.

Buna karşılık, çıkıntıların uzunluğunun optimize edilmesi, moleküler temasları ve kristal morfolojisini önemli ölçüde değiştirmiştir. Bu CK proteininin hemimetillenmiş bir DNA dubleksine bağlı olduğu kristal yapısı, protein ve DNA'nın göreceli boyutuna rağmen DNA dubleksinin serbest yüzünün kristal temaslarına girmediğini, simetri eşleri arasındaki etkileşimlerin çoğunun protein-protein ve protein-DNA etkileşimleri aracılığıyla gerçekleştiğini doğrulamıştır. İlginç bir şekilde, bu özel durumda, beş prime dinükleotid çıkıntısının faydalı etkisi, psödo sürekli bir DNA oluşumundan kaynaklanmamaktadır.

Bunun yerine, metillenmiş zincirin beş prime ucu DNA eksenlerinden uzağa doğru uzanır ve kompleksin proksimal CK molekülü ile etkileşime girer; bu durum, kristal paketlemesini değiştirmek için neden kesin olarak iki nükleotide ihtiyaç duyulduğunu açıklamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, proteinlerin nasıl saflaştırılacağı ve protein-DNA kompleks kristalizasyonu için DNA duplekslerinin nasıl tasarlanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu protokolün CK-DNA kompleksini kristalize etmek için geliştirilmiş olmasına rağmen, DNA uzunluğunun, dizisinin ve uçlarının rasyonel optimizasyonunun, diğer protein-DNA komplekslerinin kristalizasyonu için DNA dupleks tasarımlarına yönelik genel bir çerçeve sunduğunu unutmamak önemlidir.