Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, nematod konakçısı içindeki floresan işaretli bakteriyel simbiyozun gözlemlenmesidir. Bu, öncelikle bakterilerin konjugasyon yoluyla floresan bir proteinle işaretlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise yumurtaların toplanmasıyla AIC nematodlarının izole edilmesidir.

Ardından, doğal ilişkilenmeye ve nihayetinde bakteriyel simbiyontun nematod konakçı içindeki lokalizasyonuna izin vermek için AIC nematodları, floresan işaretli bakteriyel simbiyontları ile birlikte büyütülür. Nematod popülasyonu içindeki bu ilişkilenme sıklığı, floresan mikroskopi ile belirlenebilir. Bu yöntem; bakterilerin konakçıları içinde nereye lokalize oldukları ve bakteriyel taşıyıcılığın konakçı popülasyonu genelindeki dağılımı gibi simbiyoz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bakteriyel suşların gece boyu büyümesinin ardından, donör, resipiyent ve yardımcı suşları, 1:100 kültür-besiyeri oranında antibiyotik içermeyen besin açısından zengin büyüme besiyerine alt kültürleyin ve ardından kültürleri, her suş için uygun olan sıcaklıkta orta logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar büyütün. Sonrasında, suşları tek bir mikro santrifüj tüpünde birleştirin ve karışık kültürleri 17,900 Gs'de iki dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı dökün ve peleti 30 µL taze besiyerinde süspande edin. Ardından, süspansiyonu antibiyotik içermeyen besin açısından zengin bir besiyeri plağına damlatın ve damlanın kurumasını bekleyin.

Plakayı, alıcı bakteri için optimal, donör ve yardımcı hücreler için (varsa) uygun olan bir sıcaklıkta, ters çevrilmiş şekilde gece boyunca inkübe edin. Ardından, lekeyi kazıyın ve saf bir bakteri kültürü elde etmek amacıyla selektif antibiyotik plakasına tek koloni oluşumu için ekim yapın; izolasyon için tek bir koloni seçin. Son olarak, elde edilen kolonilerin donör suş değil, alıcı simbiyont olduğundan emin olun.

Resipiyente özgü fenotiplerin varlığı taranarak. Örneğin, katalaz testi yapılarak cino abdi bakterileri e coli'den ayırt edilebilir; floresan plazmid proteinine karşılık gelen dalga boyu altında floresans doğrulanarak plazmidin varlığı taranır. Doğal bakteriyel simbiyont gece boyunca büyütüldükten sonra, bakteriyel kültürün 600 µL'sini sekiz ila 10 adet 10 mm'lik lipid agar plaklarına yayınız ve ardından plakları karanlıkta, nem olmadan 25 °C'de inkübe ediniz.

İki gün sonra, 500 mikrolitre besiyeri içinde bulunan 5.000 enfeksiyöz juvenil nematodu bakteriyel lawns üzerine ekleyin. Plakaları 25 derece Celsius'ta üç gün daha inkübe ettikten sonra, bir mikroskop lamı üzerine 20 mikrolitre su yerleştirin. Ardından, bakteriyel lawn üzerinden küçük bir miktar nematodu sıyırıp almak için steril bir çubuk kullanın.

Nematodların yüzüp ayrılmalarına izin vermek için çubuğu suyun içine yerleştirin. Bu lamı düşük büyütmede inceleyin. Yumurtalar ve dişiler görünürse işleme devam edin; dişiler yumurta içerdiğinde, plakaların yüzeyine birkaç mililitre su ekleyin, plakaları hafifçe çalkalayın ve ardından suyu 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın.

Nematodlar plakalardan ayrılmalı ve plaka yüzeyinde artık görünür olmamalıdır. Nematodların tüpün dibine çökmesini bekleyin, ardından tüpün üst kısmındaki fazla suyu pipetle çekin ve tüpü temiz su ile yeniden doldurun. Erişkin nematodların çökmesini bekleyip fazla suyu bir kez daha pipetle çektikten sonra, konik tüpleri yumurta solüsyonu ile doldurun.

Ardından tüpleri oda sıcaklığında tam olarak 10 dakika boyunca hafifçe alt üst ederek karıştırın. Çalkalama işleminden hemen sonra konik tüpleri, fren açık konumdayken oda sıcaklığında 1, 250 Gs hızında tam olarak 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Sonra süpernatanı hızlıca dökün, peleti pipetleme yoluyla yumurta çözeltisi ile yeniden süspande edin ve konik tüpü taze yumurta çözeltisi ile doldurun.

Tüpü üç ila beş kez altüst ederek yumurta süspansiyonunu iyice karıştırın ve ardından hemen yumurtaları çöktürüp süpernatanı az önce gösterildiği gibi dökün. Peleti pipetleme yoluyla misogyny besiyeri veya LB ile yeniden süspande edin ve ardından yumurta süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Şimdi 15 mililitrelik tüpü LB ile doldurun, yumurtaları az önce gösterilen hızlı adım tekniğini kullanarak besiyerinde üç kez yıkayın ve ardından yeniden süspande edilen P nematod yumurtalarını mikrolitre başına en az 10 yumurta olacak şekilde seyreltin.

Yumurtaları, beş mililitre LB ve kolonize olan bakterilere karşı antibiyotikler içeren altı santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Plaka, gece boyu büyüme ve floresan bakterilerin seçilmesinden sonra streç filmle sarılmış halde dört güne kadar saklanabilir. Bakteri kültürünün 600 mikrolitresini 10 milimetrelik lipid aeratlarına yaymak için steril bir çubuk kullanın ve kültürü 25 derece Celsius'ta inkübe edin.

İki gün sonra, her lipid plakasına 500 ila 5.000 nematod yumurtası dağıtın. Plakalar önceden saklanmışsa, yumurtaları daha önce hazırlanmış bakteri çimlenmelerine eklemeden önce, az önce gösterildiği gibi en az bir kez 15 mililitre LB ile yıkayın. Ardından, enfektif juvenil formlar plağın kenarında bulanık beyaz bir halka şeklinde görünene kadar, nematod-bakteri ko-kültürlerini nem olmadan karanlıkta 25 °C'de inkübe edin.

Enfektif juvenililer gözlemlendiğinde, lipid agar plağının kapağını çıkarın ve plağın tabanını boş bir 100 milimetre x 20 milimetre Petri kabının tabanına yerleştirin. Ardından Petri kabını, küçük plağın yüksekliğinin yaklaşık yarısına gelecek kadar suyla doldurun ve progeni enfektif juvenililer suya çıkana kadar su tuzağını inkübe edin.

Nematodlar sudan veya uygun bakteri kültüründen istenen yaşam evresinde toplandıktan sonra, birkaç tane ole kristalini 30 µL suda çözün ve her 50 µL nematod örneği için bu felç edici ajandan bir ila iki µL ekleyin. Ardından, felç edilmiş nematod örneğinden yaklaşık 20 ila 30 µL'yi bir mikroskop lamına aktarın ve örneğin üzerine bir lamel yerleştirin. Nematodların görüş alanında olduğundan emin olmak için ışık mikroskobu ile inceleyin.

Bakteriyel lokalizasyonu belirlemek için; nematodların ışık mikroskobu ayarına ek olarak floresan mikroskobu altında fotoğraflarını çekin ve ardından görüntüleri üst üste bindirin. Bakterileri bulmak için nematodun birkaç farklı büyütme oranı ve görünümü denenmesi gerekebilir.

İki farklı ortamdaki nematod popülasyonları sayılmış ve bakteriyel simbiyont tarafından kolonize edilme durumlarına göre puanlanmıştır. Sağlam istatistikler elde etmek için, tabloda görüldüğü üzere, örnek başına en az 100 nematodun sayılması ve her kategoriye en az 30 nematodun düşmesi en uygunudur. Bu nematodlar, lipid agar üzerinde büyütüldüklerinde yaklaşık %14,6 ve karaciğer-böbrek agar üzerinde büyütüldüklerinde %68,6 oranında kolonize olmuştur.

Diğer nematod ve bakteri türlerinin farklı kolonizasyon seviyelerine sahip olduğu gösterilmiştir. Bu şema, Steiner NEMA dişilerinin genel görünümünü göstermektedir. Ek görsel, 20 x büyütmede bir S fot grafik dişisinin diferansiyel kontrast görüntüsünü göstermektedir.

Ek köşedeki siyah ok vulvayı, beyaz oklar ise görünür yumurtaları göstermektedir. Bu görüntü, 40 x büyütmede gelişmiş ancak henüz açılmamış bir volt nematod yumurtasını göstermektedir; Volta nematodlarından izole edilen bu yumurtalar ise 10 x büyütme altında görüntülenmiştir. Burada, Xeno aptus bakterileri ile ilişkili Steiner Nima nematodlarının temsili mikroskop görüntüleri ilk resimde sunulmuştur.

Bu kompozit görüntüyü oluşturmak için Alvin'in nematodları, GFP eksprese eden bakteriyel simbiontları ile ilişkilendirilmiştir. Bir faz kontrast görüntüsü, bir floresan görüntü ile üst üste bindirilmiştir. Ok, enfektif juvenil nematodun içinde bulunan bakterileri göstermektedir.

Bu görüntü, GFP eksprese eden X nla'ya sahip bir S carpa capsi juvenil nematodu göstermektedir. Görüntü, önceki görüntüye benzer bir şekilde oluşturulmuştur ve juvenil nematodun intestinal lümeni boyunca yerelleşmiş yeşil çubuklar olarak görülen, yeşil floresan proteinle işaretlenmiş bakterileri betimlemektedir. Açıklanan prosedüre ek olarak, konak-mikrop etkileşimi için gerekli moleküler mekanizmalar nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, bakteriyel simbiyontun nematod konakla ilişki kurmadan önce genetik manipülasyonu gibi diğer yöntemler de dahil edilebilir.