Serbestçe Mikro-organizmalar Yüzme Kantitatif Locomotion Eğitim Lazer Kırınım kullanma
25 Ekim 2012
Serbest yüzme nematod gibi mikroskobik organizmalar C. elegans, Yaşamak ve karmaşık üç boyutlu ortamda davranırlar. Biz analiz sağlar yeni bir yaklaşımı üzerine rapor C. elegans Kırınım desenleri kullanılarak. Bu yaklaşım, bir küvet ile lazer ışığı yönlendirerek oluşturulan kırınım desenleri zamansal dönemsellik izleme oluşur.
Bu prosedürün genel amacı, serbestçe yüzen mikroskobik organizmaların çırpınma frekanslarını ölçmektir. Bu işlem, öncelikle mikroskobik solucanlardan oluşan bir örnek hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, optik düzenek hazırlanır.
Ardından, canlı organizmalar tarafından oluşturulan difraksiyon deseni kaydedilir. Son olarak, yüzme frekanslarını belirlemek için kaydedilen veriler analiz edilir. Nihayetinde, kısıtlanmamış solucanların lokomosyon modellerindeki değişiklikleri göstermek için difraksiyon analizi kullanılır.
Bu tekniğin geleneksel mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, türün üç boyutlu bir alanda serbestçe hareket ederken yüzme modellerinin gözlemlenebilmesidir. Bu yöntem, serbestçe yüzen C. elegans hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra, farklı koşullara maruz bırakılan diğer şeffaf, küçük ve mikroskobik organizmalar için de uygulanabilir. Video analizi için C. elegans kurulumu yapmak üzere, 10 ila 20 adet yetişkin nematodu taze NGM ortamına taşımak için düzleştirilmiş bir platin tel piket kullanmaya başlayın.
E. coli'nin küçük dairesel lekeler şeklinde bulunduğu agar dolgulu Petri plakları. Nematodların üç ila beş saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin ve ardından yetişkinleri uzaklaştırın. Böylece, 50 ila 150 nematoddan oluşan gelişimsel olarak senkronize küçük bir kültür oluşturun; nematodları erken yetişkinlik evresine kadar büyütmek için Petri kaplarını 20 °C'de dört ila beş gün inkübe edin.
Video analizinin yapılacağı gün, senkronize kültürden 50 ila 150 adet solkanla toplamak için genç yetişkin nematodların bulunduğu bir plakayı bir mililitre deiyonize distile su ile yıkayın. Solkanları tüpün dibine çöktürmek için bir mikro santrifüj kullanın veya yaklaşık 15 dakika boyunca yerçekimi ile çökmelerini bekleyin. Tüpteki suyun büyük kısmını uzaklaştırın ve nematodlara yapışmış olan bakterileri temizlemek için yerine bir mililitre deiyonize distile su ekleyin.
Bir mikropipet kullanarak beş ila 10 nematodu su içinde bir kuvars vete içerisine aktarın. Optik düzeneği burada gösterildiği gibi; aşırı örnekleme için 543 nanometre helyum neon lazer, lazer ışınını vete üzerinden yönlendirmek için kullanılan iki ön yüzey alüminyum ayna, bir vete tutucu, bir projeksiyon ekranı ve saniyede yaklaşık 240 kare hızında kayıt yapabilen yüksek hızlı bir kamera kullanarak kurun. Ardından, vete'nin üst kısmını kapatmak için bir parça parafilm kullanın ve nematodları su sütununda karıştırmak için vete'yi ters çevirin.
Solucanların başlangıçta vete'nin üst kısmına yakın olması için vete'yi bir vete tutucuya yerleştirin. Aynaları kullanarak lazer ışınını vete'nin merkezinden geçirin. Nematodlar sudan daha yoğun oldukları için, projeksiyon ekranındaki su sütunu içinde yüzerken yavaşça vete'nin tabanına çökeceklerdir; iletilen lazer ışınına karşılık gelen noktayı, iletilen ışın projeksiyon ekranıyla buluştuğunda saçılmayı azaltmak için siyaha boyayın.
İletilen ışından kaynaklanan saçılmanın ortadan kaldırılması veya azaltılması, kameranın CCD dizisinin iletilen ışın nedeniyle doygunluğa ulaşmasını önleyecektir. Kırınım deseninin boyutunu ölçebilmek için, kırılan ışık görüntüsüne müdahale etmeyecek şekilde, projeksiyon ekranı üzerinde iletilen lazer ışını noktasının yanına yaklaşık beş santimetrelik bir çizgi çizin. Oda ışığını kapatın ve solucanlar lazer ışınının içinden geçerken ekrandaki kırınım görüntülerini kaydedin.
Video verilerini hazırlamak için aşağıdaki video analiz programını kurun ve videoyu programa aktarın. Yazılımı kullanarak başlangıç noktasını, iletilen lazer noktasıyla çakışacak şekilde ayarlayın. Her bir nematode tarafından oluşturulan difraksiyon görüntüsünün açısal yer değiştirmesini takip edin.
Verileri bir elektronik tabloya kopyalayıp yapıştırın ve sürekli bir grafik elde etmek için tüm negatif açılara 180 derece veya PI ekleyin. Video analiz düzeneğini kullanarak, projeksiyon ekranının hemen önüne USB portu aracılığıyla, difraksiyon deseninin merkez dışında kalan küçük bir alanına bir fotodiyot yerleştirin.
Fotodiyodu, bilgisayara bağlı olan dijital osiloskoba bağlayın. Bilgisayar ekranındaki çırpınma modellerini gözlemleyin. Verileri analiz etmek için veri setlerini ASCI veya metin formatında kaydedin.
Dalga formlarını sığdırabilen bir veri analiz programına verileri aktarmak için videoyu veya fotoğrafı kullanın. Ki-kare minimizasyonu kullanarak, çırpınma frekansını belirlemek için sinüzoidal bir eğri sığdırın. Çeşitli örneklerden elde edilen yüzme frekanslarının ortalamasını alın ve varyansı belirleyin.
Bu çalışma için veriler, tek faktörlü ANOVA ve ardından Bonferroni çoklu karşılaştırma testi kullanılarak istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Kırınım desenlerini modellemek için 0,05'ten küçük P değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Bir görüntü elde etmek için mikroskop kullanarak görüntüleri çekerek başlayın.
Bunu Mathematica'ya sürükleyin. Siyah beyazla dönüştürmek için binary eyes komutunu kullanın. Alternatif olarak, sondaki iki sayının ortaya çıkan kenarların kaba düzeyini kontrol ettiği siyah beyaz bir görüntü oluşturmak için edge detect komutunu kullanın.
Ardından, image data komutunu kullanarak görüntüyü sıfırlardan ve birlerden oluşan bir matrise dönüştürün. Matrisi dönüştürmek için forer komutunu kullanın, ardından matrisin mutlak değerinin karesini alın ve orijinal görüntüye karşılık gelen kırınım deseni olan sonuç görüntüsünü inceleyin. Ayrıca, görüntünün kontrastını ölçeklendirmek için log fonksiyonunu kullanın.
Son olarak, model kırınım desenlerini, serbestçe yüzen solucanlardan elde edilen kırınım desenleriyle karşılaştırın. Bu örnekte, bir santimetre genişliğinde, beş milimetre kalınlığında ve dört santimetre yüksekliğinde bir kuvars Q kabında sea elegance incelenmiştir. Video analizi kullanılarak tek bir solucanın örneklenmesi.
Beş milimetre kalınlığında bir vet üzerinden yapılan video analizinden elde edilen ortalama yüzme frekansı yaklaşık 2,5 hertz idi. Benzer şekilde, gerçek zamanlı veri toplama yöntemi ve dijital bir osiloskop kullanılarak tek bir solucandan örnekleme yapıldığında, yaklaşık 2,7 hertz'lik bir yüzme frekansı elde edilmiştir. Bu prosedür birçok solucan için tekrarlanabilir.
Serbestçe yüzen solucanlar üzerinde yapılan ayrıntılı bir çalışma, beş milimetrelik bir vete içinde ortalama 2,37 hertz'lik bir yüzme frekansı ortaya çıkarmıştır. Beklendiği üzere, yüzme frekansı sürünerek ilerleyen bir solucanınkinden daha yüksektir. Bu difraksiyon yöntemi kullanılarak, bir mikroskop lamıyla sınırlandırılmış bir sea elegance'in ortalama yüzme frekanslarının, daha önce yayınlanmış olan iki hertz değeriyle eşleştiği saptanmıştır.
Videoyu takiben. Bu videoda gösterilen kırınım desenlerinin veri hazırlığı ve modellemesi, yüzme kırınım desenlerinin modellenmesine olanak tanır. Geleneksel bir mikroskopla elde edilen solucan görüntüleri yardımıyla, modellenmiş kırınım desenleri sea elegance'in bir yüzme döngüsünü simüle etmek için kullanılır.
Başarılı bir model, yüzme frekanslarıyla eşleşen, fiziksel olarak uygulanabilir yüzme paternlerinin başarısından oluşur. Solucan, yüzme döngüsünün sonunda, döngünün başlangıcındakiyle aynı şekilde olmalıdır. Bu teknik uzmanlaşıldığında, bilgisayar ekranında yüzme döngüleri gözlemlenirken hızlı fotoğraf diyeti kullanılarak her solucan için bir dakikadan kısa sürede tamamlanabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, serbestçe yüzen nematodların nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Genel Bakış
Bu çalışma, difraksyon desenlerini kullanarak nematod C. elegans'ın yüzme davranışını analiz etmek için yeni bir yaklaşım sunar. Bu desenlerin zamansal periyodikliğini izleyerek, araştırmacılar bu mikroskobik organizmaların üç boyutlu bir ortamda hareketini daha iyi anlayabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Davranış Analizi
Arka Plan
- C. elegans, hareketliliği incelemek için bir model organizmadır.
- Geleneksel mikroskopi yöntemleri, üç boyutlu uzayda organizmaları gözlemlemeyi sınırlandırır.
- Difraksyon desenleri, hareket analizi için yeni bir yöntem sağlayabilir.
- Bu teknik, diğer şeffaf mikroskobik organizmalar için de uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Serbest yüzen C. elegans'ın çırpınma frekanslarını ölçmek.
- Difraksyon analizi kullanarak hareket desenlerini analiz etmek.
- Yüzme davranışı gözlemlemek için mevcut yöntemleri geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Senkronize edilmiş bir C. elegans kültürünün hazırlanması.
- Helyum neon lazer kullanarak bir optik sistemin kurulması.
- Nematodların bir lazer ışını içinden yüzerken difraksyon desenlerinin kaydedilmesi.
- Video analiz yazılımı ve istatistiksel yöntemler kullanılarak veri analizi.
Ana Sonuçlar
- C. elegans'ın ortalama yüzme frekansı yaklaşık olarak 2,37 Hz olarak ölçüldü.
- Yüzme davranışına kıyasla yüzme frekansında farklılıklar gözlendi.
- Teknik, üç boyutta hareketliliği gerçek zamanlı olarak gözlemlemenizi sağlar.
- İstatistiksel analiz, sonuçların önemini doğruladı.
Sonuçlar
- Bu difraksyon yöntemi, C. elegans'ın yüzme davranışını incelemek için değerli bir araç sağlar.
- Yaklaşım, diğer mikroskobik organizmalar için uyarlanabilir.
- Gelecek çalışmaları, çeşitli koşullardaki hareket desenlerinin etkilerini daha fazla genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of freely swimming micro-organisms using laser diffraction enables high-throughput, real-time measurement of locomotion in three dimensions, overcoming the constraints of traditional microscopy. This approach provides robust, quantitative outputs for behavioral phenotyping and functional validation in early discovery. The method supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for neurobiology and movement disorder research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of neuromuscular function in live, unconstrained model organisms.
- Supports functional target validation by measuring real-time behavioral outputs under varying conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between normal and perturbed locomotion patterns.
- Provides reproducible, quantitative endpoints for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput measurement of locomotor activity for phenotypic screening.
- Generates reproducible, quantitative data suitable for assay development and compound evaluation.
- Enables rapid comparison of locomotion metrics across experimental conditions and genetic backgrounds.
- Supports platform scalability and reuse for diverse transparent micro-organisms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral phenotyping with disease-relevant endpoints in neurobiology and movement disorders.
- Provides translational continuity from discovery through preclinical validation of neuromuscular targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, statistically validated outputs.
- Facilitates predictive de-risking for movement-related therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This laser diffraction method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling quantitative behavioral analysis from early target validation through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying neuromuscular function in live organisms.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible locomotion metrics for compound and genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative frequency measurements and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning behavioral outputs with disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse transparent micro-organism studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuromuscular target validation.
- Operational Value: Standardizes and accelerates behavioral phenotyping with high reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of movement-related therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical instrumentation and quantitative behavioral analysis.
- Needs access to laser diffraction setup, high-speed imaging, and data analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of data acquisition and statistical analysis protocols.
- Adaptable to various transparent micro-organisms with appropriate calibration.
- Limited to organisms and conditions compatible with optical diffraction and real-time imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
C. elegans Preparation for Video Analysis
2:52
Optical Setup for the Video Analysis
4:36
Video Data Preparation
5:23
Real Time Data Acquistion for Instant Observation of Swimming Frequencies and Data Analysis
6:36
Model Diffraction Patterns Using Mathematica as an Example
7:48
Representative Laser Diffraction Results
9:34
Conclusion
