Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

Bu prosedürün genel amacı, lipitlerin membran proteinleri üzerindeki etkisinin fonksiyonel ve yapısal çalışması için tekniklerin ayrıntılı bir tanımını sağlamaktır. Bu, önce voltaj kapılı potasyum kanalının ifade edilmesi ve saflaştırılması ile gerçekleştirilir. İkinci adım, iyon kanalının yeniden yapılandırılmasıdır.

Daha sonra, iyon kanalı fonksiyonel çalışması için lipid çift tabakalarındaki iyon kanallarından gelen elektriksel kayıt gerçekleştirilir. Son adım, yapının belirlenmesi için zardaki iyon kanallarının kristalleştirilmesidir. Sonuç olarak, iyon kanallarının voltaj sensörü hareketi üzerindeki lipid etkilerini araştırmak için biyokimyasal tahliller, elektrofizyolojik yöntem ve elektron kristalografik çalışması kullanılır.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, protein sulandırma ve biyo kayıtlardaki birçok teknik detay nedeniyle mücadele edeceklerdir. Umarım bu film, süreç tüm prosedürden geçmenize ve başarılı olmanıza yardımcı olur. Tüm prosedürün gösterimi laboratuvarımdan Dr.Hui Jim tarafından gerçekleştirilecektir.

Lipid hazırlığından önce 14 mililitrelik tek kullanımlık bir cam test tüpü, vidalı bir cam tüp ve kloroform içeren 250 mikrolitrelik bir cam şırınga vardı. Daha sonra 10 mililitre kloroformu test tüpüne aktarın. POPE ve POPG lipozomlarını hazırlamak için kloroformda 3.75 miligram POPE ve 1.25 miligram POPG'yi vidalı kapaklı cam tüpe aktarın.

Görünür bir kloroform kalmadığında lipitleri sürekli bir argon gazı akışı altında kurutun. Lipidi bir saat boyunca oda vakumu altında daha fazla deneyin. Daha sonra, kurutulmuş lipit girdabına 440 mikrolitre düşük tuz tamponu veya su ekleyin.

Lipitleri nemlendirmek için tüp. Lipid süspansiyonu beyazımsı ve bulanık görünmelidir. Bundan sonra, vezikül çözeltisi yarı saydam hale gelene kadar lipid süspansiyonunu buz gibi soğuk bir banyo sonikatında sonikleştirin.

Daha sonra 50 mikrolitre üç molar potasyum klorür ve 10 mikrolitre 0.5 molar DM'de karışıma, böylece son lipid süspansiyonu 300 milimolar potasyum klorür ve 10 milimolar DM'ye sahip olacak şekilde çözeltiyi bir döndürücüde oda sıcaklığında iki saat inkübe edin lipid deterjan karışık M hücrelerinin oluşumuna izin vermek için. İnkübasyondan sonra, küçük ELLA veziküllerinin deterjanla indüklenen füzyonu nedeniyle süspansiyon biraz bulanık hale gelmelidir. Protein mililitre başına iki miligramdan fazla konsantre edildiğinde, bir mililitre nihai hacim oluşturmak için listelenen bileşenleri, lipit deterjan karışımını ekleyin.

Daha sonra protein lipid deterjan karışımını cam tüp içinde bir döndürücüde iki saat daha inkübe edin. KVAP'ın deterjanla çözündürülmüş DTaP veya DOGS ile karışım halinde hazırlanması, P-O-P-E-P-O-P-G vezikülü için lipit preparatına benzer. Bununla birlikte, hidratlı lipitlerin küçük unli veziküllere sonikasyonu, P-O-P-E-P-O-P-G lipitleri için olandan daha uzun zaman alır, DOGS vezikülleri birbirleriyle yavaşça kaynaşabilir ve dote veya DOGS'u tamamen çözündürmek için küçük yağlı damlacıklar oluşturabilir.

Sonikasyonlu veziküller 10 milimolar DM ve 40 milimolar beta og ile karıştırılır. Lipid deterjan karışımı gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve karışım oldukça berrak olmalı ve herhangi bir küçük parçacık veya damlacık içermemelidir. Daha sonra, KVAP proteinini, bir ila 10'a eşit veya daha küçük bir protein-lipit oranında deterjanda çözündürülmüş DTaP veya DOGS ile karıştırın.

Protein deterjan lipid karışımının, sürekli yörünge dönüşü ile iki ila üç saat boyunca bir oda sıcaklığında inkübe edilmesine izin verilir. DM ve Beta og gibi nispeten yüksek CMC'ye sahip deterjanların yavaş uzaklaştırılmasını göstermek. İlk olarak, her bir mililitrelik karışım için iki litre diyaliz tamponu hazırlayın.

Daha sonra uygun uzunlukta bir diyaliz tüpü kesin ve tüpte sızıntı olup olmadığını kontrol etmek ve emin olmak için DI suyu ile yıkayın. Ardından, protein lipid deterjan karışımını diyaliz tüpüne yükleyin. Borunun her iki ucunu da çözeltinin üzerinde minimum boşluk kalacak şekilde sıkıştırın.

Yüklü hortumu, tüp çözelti içinde yavaşça dönecek şekilde diyaliz tamponundaki bir karıştırma plakasına yerleştirin. Diyaliz tamponunu her sekiz saatte bir değiştirin. Şimdi polistiren boncukları, önce 0.5 gram kuru boncuk kanatlayarak düşük CMC'ye sahip deterjanların çıkarılması için hazırlayın.

Daha sonra bunları 50 mililitrelik bir Corning tüpüne koyun ve 20 mililitre metanol ekleyin, çözeltiyi bir banyoda beş dakika boyunca sonikat ekleyin, sıkışmış kabarcıkları çıkarmak için beş dakika boyunca sonikat yapın ve daha sonra beş dakika boyunca 5.000 RP'de boncuklar üzerinde harcayın, metanolü tamamen boşaltın ve yıkamayı etanol ve milli Q suyu ile tekrarlayın. Daha sonra yıkanmış boncukları dört santigrat derecede% 20 etanolde saklayın ve kullanmadan önce deterjan içermeyen bir tamponla değiştirin. İşlem görecek protein lipid deterjan karışımındaki deterjan miktarını tahmin edin ve deterjanları çıkarmak için gereken boncuk miktarını hesaplayın.

Islak boncukları fazla su olmadan tartın ve doğrudan protein karışımına ekleyin ve boncukların tam olarak etkili olması için en az 15 ila 20 dakika bekleyin. Bir mililitre çözeltide 8.7 miligram DDM'yi çıkarmak için, biyo boncuklar gibi toplam 87 miligram polistiren boncuk, SM iki beş eşit parçaya bölünür. Protein lipid deterjan karışımını her fraksiyonla 20 ila 30 dakika boyunca oda sıcaklığında sabit uçtan uca dönüşle karıştırın.

Boncukları aşağı doğru döndürün, ardından süpernatanı bir sonraki boncuk fraksiyonuna aktarın ve sonuna kadar tekrarlayın. Bu adımda, bir cam test tüpünü ve kehribar şişeyi Teflon yüzeyli vidalı kapakla ve kloroform içeren bir dizi cam şırınga ile temizleyerek başlayın. Daha sonra kehribar şişeyi bir argon gazı akışı altında kurutun.

Daha sonra, kloroformda 0.75 miligram POPE ve 0.25 miligram POPG'yi köz şişesine aktarın ve kloroformu argon gazı ile buharlaştırın. Bundan sonra, kurutulmuş lipitleri çözmek için şişeye 0.2 mililitre pentan ekleyin ve artık kloroformu çıkarmak için tamamen kurulayın. Daha sonra, kurutulmuş lipiti çözmek için şişeye 50 mikrolitre dekan ekleyin.

Şimdi, iki katmanlı kabın silindirik yüzeyindeki yuvarlak deliği, deliğe herhangi bir lipit çözeltisi almadan lipitlerle boyayın. Lipid içindeki KVAP kanallarından katmanlar halinde elektrik kayıtları yapmak için on yılın tamamen buharlaşması için bir ila iki dakika bekleyin. Kabı kayıt haznesine yerleştirin, tuz köprülerini yerleştirin ve elektrotları kayıt kabının iki tarafına bağlayın.

Kist solüsyonunu elektrot deliklerine ve CYS ve trans solüsyonunu haznedeki dış ve iç kaplara ekleyin. Ardından, kabın iki tarafı arasındaki potansiyel ofseti iki milivolttan daha az olacak şekilde ayarlayın ve ardından kapaktaki delik boyunca lipit boyayın. Zar incelene ve nispeten stabil hale gelene kadar bekleyin.

Membran stabil hale gelir gelmez. P iki pipet ucunun ince ucunu deliğin hemen üzerine yerleştirerek vezikül içeren 0,5 ila bir mikrolitre kanal çekin. Veziküller delikten bardağın dibine düşer.

Çift katmandaki KVAP kanallarını test etmek için. 80 milivoltluk kısa bir darbe, hızlı inaktivasyon ve bir aktivasyondan yavaş geri kazanım nedeniyle eksi 80 milivoltluk tutma potansiyelinden verilir, uzun bir aralıkta, PEPG membranlarındaki kanallar için yaklaşık 120 saniye iki darbe arasında verilir. Akımın boyutu iyi göründüğünde, düşük konsantrasyon tarafına ilave iyon tuzları ekleyerek zarın her iki tarafındaki çözeltilerdeki iyon konsantrasyonlarını dengeleyin.

İşte kristal optimizasyonunun ortası olan negatif lekeli bir 2D kristalin görüntüsü. Kristaller, bazen birbirleriyle yığdıkları şeker nedeniyle% 6 amonyum moate, pH 6.4 ve% 0.5 trioz ile boyandı. Buradaki siyah kare kutu, kırınım noktaları ile kırınım desenine yol açan bir alanı belirtir.

Yaklaşık 20 angstrom'a gidiyoruz, burada daha önce gösterilene benzer bir örnekten 2D kristalin bir kriyo EM görüntüsü var. Numune% 3 TLO'lar ile karıştırıldı ve doğrudan daldırma ile donduruldu ve 50.000 güvertede bir kriyo EM altında görüntülendi. Kristal ambalajda yerel kusurlar olduğu açıktır.

İşte daha da optimize edilmiş bir kristalin başka bir cryo-EM görüntüsü. Örnek% 0.75 tanen ve% 10 ağaç merhaba içine gömüldü ve görüntü 50.000 x'te çekildi. Sıkı ambalajdaki düz çizgiler, kanalların bu tür kristallerde iyi sıralandığını gösterirken, iki siyah ok kare vektörleri işaret ediyor.

Bu videoyu izledikten sonra, lipit ve proteinin nasıl düzgün bir şekilde işleneceği konusunda iyi bir fikir edineceğinizi umuyorum ve bu video umarım lipit proteinini zarda daha verimli bir şekilde hareket ettirmek için çalışmanıza yardımcı olacaktır.