Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon
2 Mayıs 2010
Bu video nöronların genetik olarak tanımlanan gruplar aksonal yollar kullanarak embriyonik civciv omurilik görselleştirmek için nasıl gösterir Ovo Muhabiri genlerin kontrolü altında belirli artırıcı unsurların elektroporasyon.
Merhaba, ben Kudüs İbrani Üniversitesi tıp nörobiyoloji bölümündeki Dr. Review Klar laboratuvarından Ham. Merhaba, ben Sophie Esman, ben de Lars laboratuvarındayım. Bugün sizlere in vivo elektroporasyon ve omurilik açık kitap hazırlama prosedürünü göstereceğiz.
Laboratuvarımızda bu prosedürü, embriyonik omurilikteki genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonların aksonal yollarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, döllenmiş beyaz leghorn tavuk yumurtalarını oda sıcaklığından, tercihen sallantılı tepsileri olan 37 ile 38 °C arasındaki nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın.
Canlı ve senkronize embriyolar elde etmek için inkübatörün sıcaklık ve neminin izlenmesi önemlidir. Civciv embriyoları, enhancer bağımlı spesifik ekspresyon için optimal bir evre olan hamburger ve Hamilton veya HH evre 18 ile 20'ye ulaştıklarında elektropore edilir. Bu evrede baş, gövdeye dik açıdadır.
Ayrıca HH evre 18 ila 20'de, anterior, posterior sağ ve sol vital hat damarları gibi geniş bir ekstra embriyonik kan damarı seti de görülmelidir. Civciv embriyoları 66 saatlik inkübasyonun ardından HH evre 19 ila 20'ye ulaşır; bu aşamada yumurtalar inkübatörden çıkarılmalıdır. Yumurtalar çıkarıldıktan sonra yatay konuma getirilmeli ve beş ila 10 dakika beklenmelidir. Embriyo şu anda yumurtanın üst kutbunda yer almaktadır.
Elektroporasyon öncesinde, embriyolar için mililitre başına 100 ünite penisilin ve mililitre başına 0,1 mg streptomisin içeren Hank çözeltisi hazırlanır. Mikrolitre başına iki ila beş µg konsantrasyonunda istenilen DNA karışımı hazırlanır ve enjekte edilen DNA'nın kolayca görüntülenebilmesi için karışıma birkaç tane fast green boyası eklenir. Ayrıca bir ağız pipeti, steril şırınga iğnesi, küçük makas ve bant hazır bulundurulur.
Bir pipet çekici kullanarak 0,5 milimetre çapındaki cam kılcal tüpleri çekerek mikro kapillerleri hazırlayın. Tungsten elektrotları mikro manipülatörlere yerleştirin ve elektrotları puls jeneratörüne bağlayın. Puls jeneratöründeki voltajı -30 volt, her bir pulsun süresini 50 milisaniye ve puls sayısını üç olarak ayarlayın.
Embriyoları açığa çıkarmadan ve onlarla işlem yapmadan önce elektroporasyona geçin. Yumurtanın dar kutbuna bir şırınga yerleştirin ve her yumurtadan beş ila altı mililitre albümin çekin. Albümin, dökülmesini önlemek amacıyla uzaklaştırılır.
Bir sonraki adımda kesme işlemi yapılırken küçük makas kullanın. Civciv embriyosu açığa çıkarıldıktan sonra yumurtanın üst tarafında oval bir pencere açın ve burayı 0.5 ile 1 mL hanks ve penisilin streptomisin çözeltisi ile nemlendirin. Ardından, cam mikro kılcal tüpü doldurmak için bir ağız pipeti kullanın.
DNA boya karışımı kullanılarak, uygun çapta bir mikro kılcal boru DNA ile kolayca doldurulmalıdır. Binoküler görüş altında, DNA'yı nöral tüpe enjekte etmek için embriyoyu konumlandırın. Embriyoyu kuyruğu size bakacak şekilde yerleştirin.
Bu gelişim aşamasında spinal kord net bir şekilde görünür durumdadır ve bu nedenle herhangi bir kontrast tekniğine gerek yoktur. Spinal kord hem baş hem de kuyruk ucundan kapatılmıştır. Bununla birlikte, mikro kapiler delmelerle nöral tüpte daha fazla delik oluşturun ve tüpe sığ bir açıyla girin; yeterince ince ve uygun çapta bir mikro kapiler, tübe zarar vermeden içeri girmelidir.
DNA'yı bir ağız pipeti kullanarak enjekte edin. Uygun çapta bir mikro kapiler, DNA'yı düzenli bir ekshalasyonla salmalıdır. Yeşil boya, kuyruk ucundan gelişmekte olan beynin veziküllerine kadar yayılmalıdır.
Nöral tüp DNA ile dolana kadar enjekte edin; enjekte edilen DNA'nın hücrelere girebilmesi için DNA elektroporasyonu gereklidir. İlk olarak, elektrotları nöral tübe paralel ve tüpün kendisine değmeyecek şekilde mümkün olduğunca yakın yerleştirin. Puls sırasında elektriksel iletkenliğin sağlanması için elektrotların sıvı ile kaplı olduğundan emin olun.
Genellikle embriyo açığa çıkarıldıktan hemen sonra eklenen Hank çözeltisi yeterlidir. Ancak yeterli değilse, elektrotlar konumlandırılmış ve sıvının içine daldırılmış haldeyken, pals uygulamadan hemen önce bir damla Hank çözeltisi ekleyip elektro-operasyon için pals uygulayın; ardından elektrotları dikkatlice çıkarın ve pencere ile yumurtayı bantla mühürleyin. Sonraki inkübasyon süresince embriyonun kurumasını önlemek için yumurtanın tamamen mühürlenmesi önemlidir.
Yumurtayı inkübatöre geri yerleştirin ve civciv embriyosu gelişimsel embriyonik 6. güne ulaşana kadar inkübe edin. Elektropore edilmiş embriyonun gelişimsel embriyonik 6. güne (E6) ulaştığı, yani görüntüleme zamanının geldiği 6. günde veya E6'da (elektroporasyondan üç gün sonra), embriyoyu ince makaslar kullanarak yumurtadan çıkarın ve PBS içeren silikon kaplı bir Petri kabına yerleştirin.
Membranları kesin ve embriyoyu, silikona saplanan pinler yardımıyla sabitleyerek ventral tarafından gerin. Keskin bir tungsten mikro kapiler kullanarak, tavan plağı boyunca arka beyinden kuyruğa kadar boylamsal bir insizyon yapın.
Omuriliğin her iki yanına iki ek boylamsal kesi yaparak dorsal kök gangliyonlarını veya DRG'leri omurilikten ayırın. Omuriliği sağlam bırakarak, kuyruktan başlayıp arka beyne doğru taban plağını dokudan ayırın. Son olarak, ince makas kullanarak omuriliği arka beyinden enine kesin ve omuriliği vücuttan ayırın.
Omurilik izole edildikten sonra, hind brain'den kuyruğa kadar olan kısmı sabitlemek için pinler kullanarak, PBS içeren yeni bir silikon kaplı Petri kabına yayın ve düz bir montaj (flat mount) preparatı oluşturun. Omuriliği oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS içindeki %4 paraformaldehitte sabitleyin; omuriliğin açık şekilde monte edilmesi için detaylandırılan ve ekteki yazılı protokole uygun olarak immünohistokimya prosedürünü takip ederek immün boyama yapın. Görüntüleme için preparatı hazırlayın.
Bir lam üzerine dikdörtgen şeklinde gres veya silikon yayın ve dikdörtgenin içine PBS damlatın. Omuriliği, dikdörtgenin ortasına gelecek şekilde germek için cımbız kullanın ve etrafındaki sıvıyı çekin. Bir pastör pipeti ile omuriliğin üzerine bir ila iki damla montaj medyumu damlatın ve üzerine bir lamel kapatın.
Hava kabarcıklarını önlemek için lamelle üzerine basınç uygulayın. Lamları dört derece Celsius sıcaklıkta karanlıkta saklayın.
Omurilik konfokal mikroskopi kullanılarak incelenir. Burada, tüm nöronlarda CMV'den gelen yaygın bir enhancer elementi kullanılarak RFP'nin eksprese edildiği kontrol deneylerinde, civciv omurilik internöronlarının aksonal projeksiyonlarına ait bazı temsili sonuçlar yer almaktadır; nöronların ve aksonlarının çoğu işaretlenmiştir. Nöronal alt popülasyonların aksonal yollarını çözümlemek bu durumda imkansızdır.
Bununla birlikte, belirli geliştirme elementleri uygulandığında, bu örnekteki belirli bir alt popülasyon DI iki nöronun tanımlanmış bir aksonal yolu ortaya çıkar. Böylece, E 3 evresinde belirli bir nöronal geliştirici ile bir tavuk nöral tüpünün nasıl elektro-operasyonla yönetileceğini ve E 6 evresinde açık kitap omurilik preparatının nasıl hazırlanacağını göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken dikkatli ve sabırlı olmayı unutmamalısınız.
İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz. İyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu video, in ovo elektroporasyon kullanarak embriyonik civciv omuriliğindeki genetik olarak tanımlanmış nöronların aksonal yollarının görselleştirilmesi prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, araştırmacıların aksonal yörüngeleri etkili bir şekilde incelemelerine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- Aksonal yolların anlaşılması, nörobilim araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
- In ovo elektroporasyon, reporter genleri aktarmak için kullanılan bir tekniktir.
- Embriyonik civciv omuriliği, nöronal gelişimin incelenmesi için bir model görevi görür.
- Genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonlar, spesifik nöral devreler hakkında içgörüler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Embriyonik omurilikteki aksonal yolakları görüntülemek.
- Gen ekspresyon çalışmalarında in ovo elektroporasyon yöntemini kullanmak.
- Nöronal gelişim ve bağlantısallık hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Döllenmiş tavuk yumurtalarını nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın.
- İnkübasyonu 37 ile 38 °C arasında sürdürün.
- Reporter genleri aktarmak için in ovo elektroporasyon uygulayın.
- Görselleştirme için spinal kord açık kitap preparatları hazırlayın.
Ana Sonuçlar
- Omurilikteki aksonal yolların başarılı şekilde görselleştirilmesi.
- In ovo elektroporasyonun etkinliğinin gösterilmesi.
- Genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonların yörüngelerine ilişkin bilgiler.
- Nöronal gelişimi incelemek için güvenilir bir yöntemin oluşturulması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, nörobilim araştırmaları için değerli bir araç sunmaktadır.
- In ovo elektroporasyon, embriyonik modellerde gen aktarımı için etkilidir.
- Aksonal yolakların anlaşılması, sinir devresi oluşumu üzerine yapılan çalışmalara ışık tutabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Alaka
Bu yöntem, bilateral etiketlemenin ipsilateral ve kontralateral projeksiyonları belirsizleştirdiği hedef doğrulamadaki temel bir sorunu çözerek, genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonlarda aksonal seyirlerin hassas bir şekilde görselleştirilmesine olanak tanır. Reporter ekspresyonunu tek taraflı in ovo elektroporasyon yoluyla nöral tüpün sadece bir tarafıyla sınırlayarak, araştırmacılar keşif sürecinin erken aşamalarında nöronal devre hipotezlerinin mekanistik risklerini azaltmış olurlar. Bu yaklaşım, nörogelişimsel hastalık modelleriyle ilgili yolak-spesifik bağlantı modellerini netleştirerek, hedef seçimindeki öngörü güvenilirliğini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Enhancer kaynaklı raporlayıcılar tarafından tanımlanan spesifik nöronal alt popülasyonların aksonal projeksiyonlarını izole ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: İpsi- ve kontralateral projeksiyon yapan aksonları ayırt etmek için tek taraflı etiketleme sağlayarak devre haritalamasındaki belirsizliği azaltır.
- Öngörücü Değer: Bir nöronal popülasyonun hastalık mekanizması için kritik olan eksitatör veya inhibitör yolaklarla etkileşime girip girmediğini netleştirerek hedeflerin biyolojik risklerinin azaltılmasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Nöronal yönlendirmenin genetik veya farmakolojik modülatörlerinin taranması için fenotipik bir okuma olarak nicelleştirilebilir aksonal yörünge verileri oluşturur.
- Operasyonel Değer: Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme ve otomatik analiz hatlarıyla uyumlu, standartlaştırılmış, tekrarlanabilir whole-mount preparatlar üretir.
- Ölçeklenebilirlik Değeri: Enhancer aktivitesinin veya elektroporasyon verimliliğinin çoklu koşul altında test edilmesine uygun olan piliç embriyosu modelini kullanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Omurgalı spinal kord modellerinde hastalıkla ilgili aksonal yolları haritalandırarak, insan nörogelişimsel bozukluk biyobelirteçleri ile uyum sağlanmasına olanak tanır.
- Mekanistik Süreklilik: Keşif aşamasındaki hedef doğrulaması ile aksonal büyüme veya yönlendirme üzerindeki devre düzeyindeki ilaç etkilerinin preklinik değerlendirmesi arasında köprü kurar.
- Riske Göre Düzenlenmiş İlerleme: Bir hedefin, fonksiyonel iyileşme veya patoloji ile bağlantılı spesifik projeksiyon modellerini modüle edip etmediğini ortaya çıkararak devam/durdur kararlarına bilgi sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez oluşturulmasından öncü bileşik tanımlanmasına kadar olan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, fonksiyonel analiz geliştirme sürecinden önce mekanistik içgörüler sunmakta ve translasyonel biyobelirteç uyumlamasını desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Nöronal alt popülasyonların ve bunların aksonal yörüngelerinin tanımlanmasında, enhancer-spesifik gen ekspresyonunun hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşiklerin akson yönlendirmesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için standartlaştırılmış, tek taraflı reporter ekspresyonuna sahip analize hazır biyolojik sistemler sağlar.
- Analitik: Aksonal projeksiyon modellerinin kantitatif uzamsal okumalarını sunarak genetik veya tedavi koşulları arasında karşılaştırma yapılmasını kolaylaştırır.
- Translasyonel Araştırma: Biyobelirteç korelasyonu için hastalıkla ilişkili aksonal yolak modelleri oluşturarak preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla nöronal hedefte genetik konstrüktların, enhancer elementlerinin veya elektroporasyon parametrelerinin iteratif testleri için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Devreye özgü ilaç etkilerini değerlendirmede kritik bir faktör olan aksonal projeksiyon yönelimini çözümleyerek, hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış elektroporasyon parametreleri (voltaj, darbe uzunluğu, sayı) ve aşamalı embriyo işleme süreçleri sayesinde tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Aksonal yolakları istenen terapötik mekanizmalarla uyumsuz olan hedeflerin erken aşamada risk analizinin yapılmasını sağlayarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Nörogelişimsel endikasyonlardaki klinik sonlanım noktalarıyla ilgili spesifik projeksiyon paternlerini modüle eden hedefleri tanımlayarak, riskten arındırılmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Embriyo evreleme, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon parametrelerinin optimizasyonu da dahil olmak üzere embriyolojik tekniklerde uzmanlık gerektirir.
- Görüntüleme için konfokal mikroskobi ile darbe jeneratörleri, mikro manipülatörler ve tungsten elektrotlar gibi enstrümantasyona bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için kullanıcılar ve laboratuvarlar arasında DNA konsantrasyonunun, enhancer element seçiminin ve elektrot yerleşiminin standardizasyonunu gerektirir.
- Modelin spinal internöronlar dışındaki diğer omurgalı sistemlere veya nöronal tiplere aktarılması durumunda adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Pratik sınırlamalar arasında embriyo canlılığının inkübasyon koşullarına karşı hassasiyeti ve tüp hasarı oluşmadan tek taraflı homojen elektroporasyon sağlamanın teknik zorluğu yer alır.
