Turnusol Testi kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti

Bu deneyin genel amacı, bakteri tespiti için basit bir modifiye turnusol testi göstermektir. Bu yöntem, E.coli ile aktive olan bir RNA parçalayan DNA enziminin, E.coli'ye yanıt olarak bir renk değişikliği oluşturmak için üreaz bazlı bir sinyal trandsdüksiyon platformu ile nasıl birleştirilebileceğini açıklar. Bu tekniğin iki ana avantajı, testin basitliği ve analite duyarlı diğer RNA parçalayan DNA enzimlerine uygulanabilirliğidir.

Prosedürü gösterenler, Dr.Yingfu Li'nin McMaster Üniversitesi'ndeki laboratuvarından yüksek lisans öğrencileri Seperh Manchehry ve Dingran Chang olacak. Metin protokolüne göre reaktifleri ve tamponları hazırladıktan sonra, bir miligram SMCC'yi 676 mikrolitre DMSO'da çözerek bir süksinimidil 4-sikloheksan-1-karboksilat veya SMCC stok çözeltisi hazırlayın. Girdap yapın ve kullanana kadar buzun üzerine yerleştirin.

Bir miligram üreazı mililitre 1x PBS cinsinden çözün ve kullanana kadar buzun üzerine koyun. Üreaz DNA'sını veya UrDNA'yı sentezlemek için, 2,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne 10 mikrolitre 100 mikromolar LD1 ekleyin. Ardından, 140 mikrolitre çift damıtılmış su ve 40 mikrolitre 10x PBS ve girdap ekleyin.

Ardından, 80,5 mikrolitre SMCC stoğu ve 159,5 mikrolitre DMSO ekleyin. Ardından, tekrar girdap yapın ve kısaca döndürmek için bir tezgah üstü santrifüj kullanın. Reaksiyonu 37 santigrat derecede bir inkübatörde veya bir ısı bloğunda 60 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından tüpe 200 mikrolitre 1x PBS, 60 mikrolitre üç molar sodyum asetat ve 1.5 mililitre soğuk %100 etanol ekleyin. Girdap yaparak karıştırın ve reaksiyonu eksi 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Çözeltiyi 20.000 kez g ve dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı çıkarın ve peleti vakum altında kurutun. Kurutulmuş pelete 400 mikrolitre üreaz stoğu ekleyin ve oda sıcaklığında 5 saat inkübe edin. 200 mikrolitre ham konjugatı önceden yıkanmış 100.000 moleküler ağırlıklı kesme santrifüj filtre kolonuna aktarın.

Sütunu beş dakika boyunca 14.000 kez g'de santrifüjleyin. Kalan 200 mikrolitre ham konjugatı kolona aktarın ve beş dakika boyunca 14.000 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, sütunu çıkarın ve iki mililitrelik yeni bir mikrofüj toplama tüpüne baş aşağı yerleştirin.

Ters çevrilmiş kolonu ve tüpü iki dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Toplama tüpünü çıkardıktan sonra, konjugatların ek geri kazanımı için zarı yıkamak üzere santrifüj kolonuna 30 mikrolitre 1x PBS ekleyin. Sütunu tekrar ters çevirin ve tekrar toplama tüpüne yerleştirin.

Kolonu iki dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Sütunu çıkarın ve atın. UrDNA'yı kullanana kadar dört santigrat derecede saklayın.

E.coli ile aktive edilmiş bir RNA parçalayan DNAzyme veya EC1 ve UrDNA'yı manyetik boncuklar üzerine monte etmek için, manyetik boncuk stoğunu iyice karıştırın ve 100 mikrolitre boncuk süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Ardından, boncukları izole etmek için tüpü manyetik bir raf tutucuya yerleştirin. Süpernatanı pipetleyerek çıkarın ve tüpe 150 mikrolitre bağlayıcı tampon veya BB ekleyin.

Tüpü tutucudan çıkarın ve boncukları homojen bir çözelti halinde yeniden süspanse etmek için tüpe dikkatlice vurun. BB ile süspansiyon halindeki boncuklar ile BB yıkamayı iki kez daha tekrarladıktan sonra, 10 mikrolitre 10 mikromolar EC1 ekleyin. Tüpe vurarak dikkatlice karıştırın.

Çözeltiyi 30 dakika boyunca hafif çalkalayarak inkübe edin. Boncukların toplanmasını önlemek için, her iki ila üç dakikada bir tüpe dokunun. Ardından, boncukları izole etmek için mikrofüj tüpünü manyetik rafa geri yerleştirin ve süpernatanı pipetleme yoluyla çıkarın.

Ardından, boncukları üç kez yıkamak için 150 mikrolitre BB kullanın. Yıkama tamamlandıktan sonra, boncukları bu solüsyonu BB.To toplam 150 mikrolitre içinde süspanse edin, 15 mikrolitre UrDNA ekleyin ve numuneyi 45 santigrat derecede iki dakika ısıtın, ardından solüsyonu oda sıcaklığına soğutun ve iki saat inkübe edin. Boncukları izole etmek için mikrofüj tüpünü manyetik rafa geri yerleştirin ve süpernatanı pipetleyerek çıkarın.

100 mikrolitre reaksiyon tamponu veya RB ekleyin, ardından tüpü manyetik raftan çıkarın ve boncukları dikkatlice yeniden askıya alın. E.coli hücrelerini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 100 mikrolitre RB ekleyerek ve vorteksleyerek 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpünü önceden yıkayın. Ardından arabelleği atın. Yıkanmış tüpe 15 mikrolitre monte edilmiş EC1 ekleyin, ardından tüpü manyetik rafa yerleştirin ve süpernatanı aspire edin.

Tüpü raftan çıkarın, 100 mikrolitre RB ekleyin ve manyetik boncukları dikkatlice yeniden askıya alın. Boncukları iki kez daha yıkamak için RB kullandıktan ve RB'yi çıkardıktan sonra, tüpe 10 mikrolitre E.coli numunesi ekleyin ve tüpün üzerine hafifçe vurarak içeriği hafifçe karıştırın. Ardından, reaksiyonu oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, 90 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin ve tüpü manyetik rafa yerleştirin. Yaklaşık üç dakikalık manyetik ayırmanın ardından, süpernatanın 85 mikrolitresini dikkatlice 0,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Manyetik boncukların hiçbirini almadan çözeltiyi dikkatli bir şekilde pipetlemek çok önemlidir.

Bu boncuklar üreaz ile yüklenir ve yanlış bir pozitif sinyal üretir. 15 mikrolitre% 0.04 Fenol kırmızısı ve 100 mikrolitre substrat çözeltisi ekleyin. Ardından, renk değişimini kaydetmek için belirli zaman aralıklarında fotoğraf çekin.

Turnusol testinin başlangıç rengi sarı olmalı ve çözelti pH'ını 5.5'in altında yansıtmalıdır. Gerekirse, turnusol testinin başlangıç pH'ı, pH beşte bir milimolar sodyum asetat tamponu gibi zayıf bir tampon ile ayarlanabilir. Bu şekil, DNAzim olarak E.coli ile aktive olan RNA parçalayan DNA EC1'in ve pH indikatörü olarak Fenol kırmızısının kullanıldığı bakteriyel turnusol testinin sonuçlarını göstermektedir.

E.coli'nin yokluğunda renk değişiminin olmamasıyla gösterildiği gibi, EC1 oldukça spesifiktir ve diğer bakterilere karşı minimum aktivite gösterir. Renk değişiminin derinliği hem DNAzyme aktivasyon adımında kullanılan E.coli hücrelerinin sayısına hem de üre hidroliz adımı için izin verilen süreye bağlıdır. Daha fazla E.coli hücresi, daha güçlü bir renk değişikliğine neden olur ve üre hidrolizi için daha uzun süre, daha az sayıda hücrenin tespit edilmesini sağlar.

Bu grafik, el tipi bir pH metre kullanılarak izlenen pH değişimini gösterir. 10 ila yedi E.coli hücresinin varlığı, 10 dakika içinde pH'da üç birim kademeli bir artışa neden oldu. Buna karşılık, E.coli'nin yokluğu aynı koşullarda saptanabilir pH değişikliklerine neden olmamıştır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, üreazın çok aktif olduğunu ve kötü yıkama veya kontaminasyonun yanlış pozitife yol açacağını hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, çevresel su kalitesi testi gibi daha ilgili koşullarda E.coli'yi test etmek için bu yöntem gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, E.coli testi için basit bir turnusol testinden yararlanmak için iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu testin son derece tehlikeli olan patojenik E.coli'yi tespit etmek için kullanılabileceğini unutmayın. Patojenik bakteriler için herhangi bir test yapmadan önce biyogüvenlik eğitimi almanız gerekir.