Mikroenkapsülasyon Uygulamaları için Ekstraksiyon Tesisi tabanlı Kapsüller

Bu prosedürün genel amacı, mikroenkapsülasyon uygulamaları için Sporopollenin Ekzin Kapsülleri veya SEC'lerile ayıklamak üzere optimize edilmiş bir süreç oluşturmaktır. Bu yöntem, gıda ve sağlık hizmetleri uygulamaları için hızlı bir şekilde temiz mikro-yakalama sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, temiz ve bozulmamış SEC'ler üretmek için SEC ekstraksiyon işlem süresinin önemli ölçüde azaltılabilmesidir.

Bu yöntem, optimize edilmiş SEC ekstraksiyon sürecine ve kapsamlı adım adım karakterizasyona dair içgörü sağlayabildiği gibi, farklı bitki tabanlı biyomalzemelerin temel mikroyapısal ve morfolojik değerlendirmelerini araştırmak için de kullanılabilir. Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, yüksek sıcaklıklarda oldukça korozif asitlerin kullanıldığı geleneksel 8 ila 10 günlük ekstraksiyon süreci nedeniyle zorluk yaşarlar. Bu prosedüre başlamak için, bir çeker ocak içerisinde cam kondenser, bir su dolaşım sistemi ve bir su banyosu içeren bir reflüks düzeneği hazırlayın.

SEC ekstraksiyon süreci yüksek derecede korozif asitler ve organik çözücü kullanımı içerdiğinden, işlem; koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü, yüz maskesi ve tehlike bildirimli eldivenler gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla gerçekleştirilmelidir. Toz oluşturmadan ve herhangi bir ateşleme kaynağından uzakta, 100 gram L clavatum sporunu dikkatlice tartın. Ardından, sporları manyetik karıştırma çubuğu içeren bir litrelik PTFE tabanlı yuvarlak baloncuğa yavaşça aktarın.

Sporlara 500 mililitre aseton ekleyin ve homojen bir süspansiyon oluşturmak için erleni hafifçe çalkalayın. Ardından erleni, 50 °C'ye ayarlanmış ve geri soğutucuya bağlanmış bir su banyosuna yerleştirin. Süspansiyonu, 200 RPM'de karıştırarak altı saat boyunca geri soğutma sıcaklığında ısıtın.

Süspansiyonun oda sıcaklığında soğumasını bekledikten sonra, vakum altında süzgeç kağıdı kullanarak süzün ve yağdan arındırılmış sporları geniş cam petri kaplarında toplayın. Solvent buharlaşması için delikler açılmış alüminyum folyo ile petri kaplarını örterek sporları oda sıcaklığında kurutun. Kurutulmuş ve yağdan arındırılmış kuru sporları bir litrelik PTFE flaska aktardıktan sonra, 500 mililitre %85 fosforik asit çözeltisi ekleyin.

Balonu 70 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve geri soğutucuya bağlayın. Süspansiyonu, karıştırarak 30 saat boyunca geri soğutma (reflüks) sıcaklığında ısıtın. Süspansiyon oda sıcaklığına soğuduğunda, 500 mL ılık deiyonize su ile seyreltin ve SEC'leri filtre kağıdı kullanarak vakumlu filtrasyonla toplayın.

Bunun ardından, bir dizi yıkama işlemi gerçekleştirmek için SEC'leri üç litrelik cam bir behere aktarın. Çeker ocak içerisinde, SEC'lerin üzerine 800 mililitre sıcak deiyonize su ekleyin ve 10 dakika boyunca nazikçe karıştırın. Ardından, süspansiyonu vakum altında filtre kağıdı kullanarak süzün.

SEC'leri temiz, üç litrelik bir cam behere aktarın. Önceki adımları beş kez tekrarladıktan sonra SEC'lere 600 mililitre sıcak aseton ekleyin ve 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın. SEC'leri vakumlu filtrasyonla toplayın ve temiz, üç litrelik bir cam behere aktarın.

Önceki adımları uygun çözücülerle tekrarladıktan sonra, temiz SEC'leri altı adet büyük cam petri kabına aktarın ve tüm suyu uzaklaştırmak için bir çeker ocakta, oda sıcaklığında 24 saat boyunca kurutun. Ardından, SEC'leri bir vakum fırınında 60 °C sıcaklıkta ve 1 mbar vakum altında 10 saat boyunca veya sabit ağırlığa ulaşana kadar kurutun. Son olarak, kurutulmuş SEC'leri kuru bir dolapta saklamak üzere bir polipropilen şişeye aktarın.

Deiyonize su içinde 1,2 mililitre Sığır Serum Albumini veya BSA çözeltisi hazırlayın ve bunu 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın. BSA çözeltisine 150 miligram SEC ekleyin. Homojen bir çözelti oluşturmak için karışımı 10 dakika boyunca vorteksleyin.

Tüpü filtre kağıdıyla kapladıktan sonra, bir liyofilizatör balonuna aktarın ve bir milibar vakum altında dört saat boyunca kurutun. BSA yüklü SEC'ler kuruduğunda, havan ve eliyle aglomeraları giderin. Şimdi BSA yüklü SEC'leri 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kalıntı BSA'yı uzaklaştırmak için iki mililitre deiyonize su ekleyin.

SEC'leri 4.704 g'de beş dakika santrifüj ederek toplayın. İşlem tamamlandığında süpernatantı uzaklaştırın. Yıkama işlemini deiyonize su ile tekrarlayın.

Bunun ardından, BSA yüklü SEC'lerin bulunduğu tüpü filtre kağıdı ile kapatın. Daha sonra, SEC'leri bir saat boyunca dondurucuya yerleştirin. SEC'leri 24 saat boyunca liyofilize edin.

SEC'leri daha sonraki karakterizasyon aşamasına kadar dondurucuda saklayın. İki mililitrelik bir polipropilen tüp içerisinde BSA yüklü SEC'lerin beş miligramını kullanın. 1,4 mililitre PBS ekleyin ve beş dakika boyunca vorteksleyin.

Bunu takiben, süspansiyonu %40 genlikte, on saniyelik üç döngü boyunca prob sonikasyonuna tabi tutun. İşlem tamamlandığında, çözeltiyi 0,45 mikronluk polietersülfon filtre kullanarak süzün. Önceki adımları plasebo SEC'ler ile gerçekleştirdikten sonra, plaseboyu kör olarak kullanarak BSA yüklü SEC'lerin absorbansını 280 nanometrede ölçün.

Son olarak, PBS içinde bir BSA standart eğrisi kullanarak enkapsüle edilen BSA miktarını belirleyin. SEM görüntüleri, benzersiz bir mikro yapıya sahip sağlam sporları göstermektedir ve işlem öncesindeki kesit görüntüsünde mikron ölçekli sporoplazmik organeller gözlemlenmiştir. Sporların yağdan arındırılması ve alkali işlemi ile herhangi bir morfolojik veya yapısal değişiklik gözlemlenmemiştir.

Asidoliz sonrası SEM görüntüleri, sporoplazmik materyallerden arındırılmış, bütünlüğü korunmuş SEC'leri göstermektedir. CHN analizi ile yağdan arındırılmış ve alkali işlem görmüş SEC'lerde önemli bir proteinli materyal kaybı gözlenmemiştir. Proteinli materyallerin büyük bir kısmı asidoliz ile uzaklaştırılmıştır.

DIPA analizi, 30 saate kadar süren asitlikten sonra SEC'lerin tekdüze boyut dağılımını göstermektedir. Uzamış asitlik ile SEC'nin yapısal bütünlüğü azalmaktadır. SEM ve DIPA verileri, yağ giderme adımından sonra asitliğin, tekdüze boyut dağılımına sahip bütün SEC'ler ürettiğini göstermektedir.

CLSM verileri, işlem görmemiş SEC'lerin spor boşluğu içindeki sporoplazma bileşenleri nedeniyle otofloresans sergilediğini göstermektedir. Sadece asidoliz işlemi uygulandıktan sonra tüm sporoplazmik içerikler uzaklaştırılır. FITC-BSA enkapsülasyonundan sonra SEC'lerin içinde yeşil floresans gözlemlenir.

SEM görüntüleri, BSA yüklemesinden sonra bozulmamış mikro-kırışıklıkları göstermektedir. SEC'lere BSA yüklendikten sonra çap, dairesellik ve en-boy oranında önemli bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Enkapsüle edilmiş SEC'lerden yapılan BSA miktar tayini, gram başına 0,170 ± 0,01 g BSA yüklemesi ile mikroenkapsülasyon sürecinin tutarlılığını doğrulamaktadır.

Bu optimize edilmiş SEC ekstraksiyon sürecinde uzmanlaşıldıktan sonra, işlem uygun şekilde gerçekleştirilirse 48 saat içinde tamamlanabilir. Çeşitli bitki sporları ve polenleri için bu prosedür uygulanırken, sağlam ve temiz kapsüller elde etmek için yapısal morfolojik ve elementel analizlerin adım adım değerlendirilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, optimize edilmiş sürecin farklı bitki tabanlı kapsüller için uygulanabilirliğini kontrol etmek amacıyla alkali enzimlerin kullanıldığı diğer ekstraksiyon işlemleri gerçekleştirilebilir.

Bu teknik geliştirildikten sonra, mikroenkapsülasyon, ilaç iletimi ve doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların, yeni nesil biyomalzemeler olarak çeşitli bitki tabanlı SEC'leri keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bitki sporlarından ve polen tanelerinden SEC'lerin nasıl ekstrakte edileceği ve karakterize edileceğinin yanı sıra, ilaçların ve biyomakromoleküllerin SEC'lere enkapsülasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.