Nöral Kök Hücre Motilite değerlendirilmesi Agaroz Jel tabanlı mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Merhaba, ben Kevin Won. Cornell Üniversitesi Biofluids Laboratuvarı'nda mühendislik yüksek lisans öğrencisiyim. Bugün, EGF epidermal büyüme faktörünün murine nöral kök hücreler üzerindeki etkisini incelemek için agaroz tabanlı bir mikroakışkan cihazın kullanımı hakkında konuşacağım.

Cihaz temel olarak, her biri 150 mikron genişliğinde olan üç mikroakışkan kanaldan oluşmaktadır. EGF yan kanallardan birine, tampon çözelti ise diğer yan kanala pompalanır. Bu düzenek, temel olarak merkez kanal boyunca statik lineer bir kimyasal gradyan oluşturur.

EGF agro jel içerisinde kolayca difüze olduğu için, nöron kök hücreleri merkez kanala ekilir ve göçlerinin ilerleyişi bir mikroskop aracılığıyla izlenir. Böylece cihazlar temel olarak, tübülere bağlanmak için tüm giriş ve çıkışların bulunduğu pleksiglas bir üst katmandan oluşur. Bunun altında ise içinde dört desenli cihaz bulunan bir agro jel membran yer alır.

Bu alan, tüm cihaz boyunca sabit bir kalınlık elde etmemizi garanti eden bir PDMS ara parçası ile çevrelenmiştir. PDMS ve jel, ect ile kaplanmış bir lam üzerine monte edilir. Bu işlem, hücrelerin lam yüzeyine tutunmasına yardımcı olur.

Ek olarak, tüm düzeneği monte etmek için paslanmaz çelik plaka kullanılır ve düzeneği vidalarla birbirine sıkıştırırız. Yabanıl tip hücre hattı, yabanıl tip EGF reseptörünü aşırı eksprese etmek için bir retrovirüs vektörü ile transfekte edilmiştir; delta hücre hattı ise EGF ligandı olmadan sürekli aktif olmasını sağlayan mutasyona uğramış bir EGF reseptörü versiyonu ile transfekte edilmiştir. Tamam, mikro akışkan düzeneğimizin montaj sürecini açıklayarak başlayacağım.

Öncelikle, masterlarımızdaki silikon mikro kanalların kabartma özelliklerinin etrafına PDMS ara parçayı yerleştirdim. Şimdi 0,3 gram agros tartacağım. Ardından 10 ml CO2 bağımsız besiyeri hazırlayıp bunu agros'a ekleyeceğim.

Şimdi, agros tozunu CO2 bağımsız besiyeri ile karıştırmak için pipetle yukarı-aşağı hareketler yapacağım. Artık mikrodalga fırına hazırsınız. Şu an görebileceğiniz gibi, agros sıvılaşmış durumda ancak hala birkaç granül kalmış.

Granülü çözmek ve hava kabarcıklarını gidermek için bunu dairesel hareketlerle sallayacağım. Erimiş agrosu silikon kalıbın rölyef özelliklerinin üzerine döküyorum ve şimdi steril bir cam lam alıp bunu PDMS ara parçanın üzerine yerleştireceğim. Agros jel içindeki hava kabarcıklarının çoğunu dışarı itmek için lamı belli bir açıyla koyuyorum.

Basınç uyguladım ve agaroz kabuğu katılaşana kadar basınç uygulamaya devam edeceğim. Bir ila iki dakika sonra katılaştı. Şimdi lam üzerindeki fazla agarozu temizleyeceğim.

Bir sonraki adım, lamı nazikçe kaydırarak çıkarmaktır ve bu lam atılabilir. Şimdi, desenli agarosları önceden fibronectin ile kapladığım bir lama nazikçe aktarmayı deneyeceğim. Temel olarak, desenli agarosları PDMS ara parçasıyla birlikte kaldırmama yardımcı olması için bu plastik steril örtüyü kullanıyorum ve desenli agarosları kanallar lama bakacak şekilde aktaracağım.

Bu parça lam üzerine sıkıca sabitlendiğine göre, plastik manifoldun kanallara erişebilmesi için münferit rezervuarlarda delikler açacağım. Bunu küçük metal bir delgeç kullanarak yapacağım. Cihazda delik açma işlemini tamamladık.

Mikro kanalların kurumasını önlemek için 500 µL CO2 bağımsız besiyeri ekleyeceğim ve şimdi bir ila iki dakika boyunca bekleteceğim. Tamam, bir ila iki dakika sonra, fazla besiyerini süzmeye çalışacağım ve şimdi desenli agar üzerindeki delikleri, pleksiglas manifoldun giriş ve çıkış delikleriyle hizalayacağım. Delikler hizalandıktan sonra, iyi bir sızdırmazlık sağlamak için sıkıca bastıracağım.

Şimdi pleksiglas manifoldu paslanmaz çelik desteklerin üzerine yerleştiriyorum ve vidaları kullanarak cihazı nazikçe birbirine kenetliyorum. Kanalların ezilmemesi için vidaları aşırı sıkmamaya çok dikkat ediyorum; ayrıca içerideki agaroz jel kalıbının kaymasını önlemek için vidaları saat yönünde sıkıyorum. 1 mL besiyeri çekeceğim ve cihazı test etmek için bu şırıngayı kullanacağım.

Gördüğünüz üzere, her bir mikrokanala sıvı enjekte ediyorum ve her bir çıkıştan sıvının çıkıp çıkmadığını kontrol ediyorum. Şu an montajı tamamlanmış cihazı mikroskobun çevreleme haznesine yerleştirdim. Burası 37 °C'de tutulmaktadır, böylece cihaz ısınacak ve hücre ekimi yapmamız gerektiğinde hazır hale gelecektir.

Gördüğünüz gibi, peristaltik pompa tüplerini düzeneğin içinden geçirdim. Şu anda deneylerimize hazırlık amacıyla tüpleri PBS ile yıkıyorum. Şimdi tüplerin kurulumunu gerçekleştireceğiz.

Parazol pompa tüplerini, önceden delikleri açılmış olan kapaklardan geçireceğim. Her tüpün üzerinde, tüpün hem girişini hem de çıkışını tanımlayabilmem için belirli sayıda çentik bulunmaktadır. Böylece, üzerinde dört çentik olan tüp 10 ng/mL alacaktır.

EGF çözeltisi için tüpler şimdi cihaza takılacak. Tüpleri, her cihazın sahip olduğu çentik sayısına göre takacağım; böylece tüpler, cihazların aldığı çözelti miktarına karşılık gelecek.

Şimdi çıkış borusunu takıyorum. Besiyerinin çıkış borusundan gerçekten aktığından ve kanalda herhangi bir tıkanıklık olmadığından emin olmak için şeffaf bir tigon boru kullanıyoruz. Şimdi peristaltik pompaları çalıştıracağım.

Şimdi hücreleri merkez kanala ekme prosedürüne başlayacağım. İlk olarak sensör kanalındaki fazla medyumu çıkaracağım. Böylece artık hücreleri görebileceğim.

Hücreler halihazırda CO2 bağımsız besiyerinde süspansiyon halindedir. Orta kanalın girişine 60 µL ve çıkışına 20 µL ekledim. Hücrelerin yerçekimi ile yönlendirilen akış sayesinde yerleşeceğini umuyorum.

Bu işlemi diğer iki hassas kanal için de tekrarlayacağım ve hücre yerleşiminin başarılı olup olmadığını görmek için şimdi bunu mikroskop altında gözlemleyeceğiz. Şu anda hücreler cam lam üzerine yapışmış durumdalar ve birkaç dakika içinde yayılmaya başlayarak kendilerine özgü morfolojilerini kazanacaklar. Bugün, asıl cihazın montajını, reaktiflerin hazırlanmasını ve cihaz içindeki hücre göçünü görüntülemek için kullandığım mikroskop tekniklerini ele aldık.

Sonuç olarak, bu cihazın özellikle klinik ortamlarda çok daha geniş bir uygulama alanına sahip olacağını umuyoruz. Şekil 1'de yatay eksende C 17.2 hücrelerinin yörüngeleri, dikey eksende ise artan EGF konsantrasyonları gösterilmektedir.

Bu, aynı EGF konsantrasyonu ile yaptığımız deneylerde kullandığımız C 17.2 hücrelerinin çeşitli suşlarının yörüngelerini göstermektedir. Parental hücre verileri, 10 nanogram per mil EGF konsantrasyon gradyanında motilitede bir zirve olduğunu göstermekte; bu da daha yüksek EGF konsantrasyonunda reseptörlerin ligand ile doygunluğa ulaştığını belirtmektedir. Yabanıl tip verileri ise, yüz nanogram per mil EGF konsantrasyonunda motilitede bir artış olduğunu göstermektedir.

Bu durum, reseptörlerin yüksek EGF konsantrasyonlarında doygunluğa ulaşmadığını göstermektedir. Hücrelerin EGF reseptörünü aşırı eksprese edecek şekilde tasarlandıkları göz önüne alındığında bu sonuç anlamlıdır. Son olarak, delta hücre hattı verileri, hücrelerin motilitesinin EGF konsantrasyonundan kabaca bağımsız olduğunu göstermektedir.

Mutasyona uğramış EGF reseptörleri, EGF varlığından bağımsız olarak aktive edilecek şekilde tasarlandığı için bu durum beklenen bir sonuçtur.