Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, bölmelere ayrılmış bir mikroakışkan cihaz aracılığıyla kanser hücresi göçünü görsel olarak incelemek ve karakterize etmektir. Bu, öncelikle serumsuz ortamda büyütülen beyin tümörü kök hücrelerinden oluşan mevcut nörosferlerin ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, çift katmanlı bir SU eight master üretmek ve yumuşak litografi yöntemiyle bölmeli bir tasarıma sahip PDMS kalıplar oluşturmaktır.

Ardından, mikroakışkan cihazı birleştirin ve beyin tümörü kök hücreleri ile yükleyin. Son olarak, tümleşik bir mikroskobik sistem kullanılarak beyin tümörü kök hücresi migrasyonunun uzun süreli zaman serili görüntülemesi gerçekleştirilir. Nihayetinde sonuçlar, beyin tümörü kök hücrelerinin ultra kısıtlanmış bir alanda migrasyonları sırasında döngüsel bir morfolojik aşamalar dizisi sergilediğini göstermektedir.

Bu tekniğin Transwell Boyden Kamerası gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mikro cihazların migrasyon sürecinin görsel olarak incelenmesine, hücrelerin kontrollü yerleşimine ve faktörlerin hassas bir şekilde iletilmesine olanak sağlamasıdır. Bu nedenle, mikro akışkan teknolojisi; güvenilir, verimli ve maliyet etkin tek hücre seçimi ve yönlendirme özelliklerine sahiptir. Yüksek migrasyon kapasitesine sahip hücrelerin tek hücre analizi, gelecekteki potansiyel kemoterapötik hedeflerin belirlenmesini sağlayabileceği için bu tekniğin etkileri kanser metastazı ve nüksetme tedavisine kadar uzanmaktadır.

Bu yöntem kanser sisteminin migrasyon davranışı hakkında içgörü sağlayabilse de, embriyonik gelişim, bağışıklık yanıtları, yara iyileşmesi ve organ rejenerasyonu gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. BTSC kaynaklı nörosferlerin hücre süspansiyonu ile başlayın. Hücreleri 15 mililitrelik konik tüpe toplayın ve beş dakika boyunca 900 RPM'de santrifüjleyin, ancak daha yüksek hıza çıkmayın.

Süpernatantı aspire edin. Ardından, nörosferlerin gevşemesi için onları 37 °C'de beş ila 10 dakika boyunca 0,5 ml ön ısıtılmış Accutane içinde inkübe edin. İnkübasyon sonrası, hücreleri bir P 100 pipeti ile 10 ila 20 kez nazikçe pipetleyerek mekanik olarak parçalayın.

Ardından, Accutane santrifüjünü nötralize etmek için 1,5 mililitre kök hücre besiyeri ekleyin, hücre süspansiyonunu 1300 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve hücreleri bir mililitre kök hücre besiyerinde yeniden süspande edin. Hücre yoğunluğunu bir hemositometre ile kontrol edin ve yoğunluğu mikrolitre başına 20.000 hücreye ayarlayın. SU eight master üretimine başlamak için, Adobe Illustrator ve Image Setter entegreli lazer yazıcı şeffaf film kullanarak iki fotomaske hazırlayın.

Birinci katman fotomaskesi, iki fidüsyel işaretçi ve bir mikro kanal dizisinden oluşurken, ikinci katman fotomaskesi yerleştirme ve alma odacıklarını içerir. Her iki maske katmanını da izopropanol ile temizleyin ve havada kurumaya bırakın. Şimdi, bir taşıyıcı gofret üzerine üç mikron kalınlığında SU eight fotoresist kaplayın ve ardından yumuşak pişirme (soft baking) işlemini gerçekleştirin.

Ardından, birinci katman fotomaskesi ile yakın temaslı UV ışınlaması yaparak fotorezisti pozlayın ve kürlenmeye bırakın. Daha sonra, kürlenmiş wafer'ı post-bake işlemine tabi tutun ve geliştirin. Taşıyıcı wafer'ın fiducial marker alanlarını scotch bant ile kapatın.

Ardından, gofere 250 micron kalınlığında fotoresist kaplayın. Sonrasında, hizalama amacıyla işaretleyicileri ortaya çıkarmak için bandı soyun. İkinci fotoresist katmanını yerleştirin ve referans işaretçilerini hizalayın.

Ardından, ikinci katman fotomaskesini UV ışığına maruz bırakarak kürleyin, sonrasında ön pişirme ve geliştirme işlemlerini gerçekleştirin. Yüzey yapışkanlığını azaltmak için SU-8 master'ı buhar biriktirme yöntemiyle stabilize edin. Waferları, vakum altında birkaç damla trikloroklorbenzen çözeltisi içeren bir desikatöre en az bir saat boyunca yerleştirin.

Kalıp, PDMS ile kalıplama yapmak için hazır hale gelecektir. İşleme, prepolimer bazını kürleyici ile 10'a 1 oranında iyice karıştırarak başlayın. Ardından, hava kabarcığı kalmayana kadar vakumla gaz giderme işlemi için karışımı bir desikatöre yerleştirin.

Karışımı maskenin üzerine dökün ve tekrar gazını alın. Eğer yeni hava kabarcıkları oluşursa, kalıbı düz bir ısıtıcı plaka üzerinde 90 °C'de iki saat boyunca kürleyin. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, PDMS damgayı nazikçe ayırın.

Böylece kültür kanalları PDMS üzerine kazınmış olur ve mikroakışkan cihazın montajı için hazır hale gelir. Master kalıp, çatlayana veya aşınana kadar kalıplama için yeniden kullanılabilir. Master kalıp yapışkan hale geldiğinde, yapışma önleyici kaplama yeniden uygulanabilir.

PDMS kalıp üzerinden mikroakışkan cihazda giriş ve çıkışların oluşturulmasıyla başlayın. Biyopsi delme aleti kullanarak, PDMS kalıbı 30 dakika boyunca %70 etanol içinde bekleterek temizleyin ve ardından 10 dakika boyunca deiyonize su ile durulayın. PDMS kalıbı otoklavlayarak sterilize edin ve çapraz bağlanma reaksiyonlarını tamamlayın.

Şimdi PDMS damgayı, poli L-lizin ile kaplanmış bir cam lam üzerine yerleştirin. Ardından, hazne girişlerinden laminat çözeltisi doldürülerek cihaz laminat ile kaplanır ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün, cihazdaki laminatı aspire edin.

Ardından cihazı, iki kez kök hücre besiyeri ile doldurup boşaltarak yıkayın. Şimdi, bir ekim rezervuarına 11 µL disosiye edilmiş hücre yükleyin. Gerekirse, hücreleri hazneye itmek için vakum aspirasyonu kullanın. Daha sonra, yanındaki ekim rezervuarına yedi µL daha hücre yükleyin.

Beş dakika sonra, yerleştirme ve karşılama rezervuarları besiyeri ile dolacaktır. Şimdi, cihazın üzerine 0,5 ila bir milimetre kalınlığında steril bir PDMS tabakası yerleştirin. PDMS'in kendi yüzeyine doğal yapışma özelliği cihazı mühürleyecektir; mühürleme işlemi tamamlandığında cihaz taşıma, inkübasyon ve mikroskobik görüntüleme için hazır hale gelir.

Biot IM cihazını 45 dakika boyunca çalıştırarak ön dengelemeye tabi tutun. Sıcaklığını, nemini ve hava beslemesini stabilize etmek için, uygun nem düzeyini sağlamak amacıyla örnek haznesine birkaç kap su ekleyin. Hazırlanan cihazı mikroskobun örnek haznesine yerleştirin.

Cihazı mikro cımbız kullanarak merkezleyin. Şimdi Biot yazılımını kullanarak odak pozisyon noktalarını ve zaman noktalarını ayarlayın ve gerekirse zaman atlamalı kayıtları başlatın. Kültürde beş gün geçtikten sonra, kültür medyasını değiştirin.

Cihaza ekilen BTC'ler, faz görüntüsüyle sürekli olarak kaydedildi. Oturma odasında beş gün boyunca, iğ şeklinde hücreler migrasyon öncesi aşamada kaldı. Mikrokanal girişine yaklaştıklarında, birkaç hücre genişledi ve yapışkan çıkıntılar oluşturdu.

Sadece tek bir hücre girişi işgal edebilmiş ve göç yönünü keşfedebilmiştir. Hücre göç yönünü belirledikten sonra, tüm mikrokanalda sabit yüksek hızda ilerlemiştir. Mikrokanalın sonunda hücre, alıcı bölmeye nihai olarak girmeden önce bölmenin açık alanını keşfetmiştir.

İki saniyelik iki görüntüleme aralığıyla hücrelerin gözlemlenmesi sonucunda, göç hareketinin çoğunlukla OID hücrelerininkine benzer bir "blabbing" aktivitesi tarafından üretildiği görülmüştür. Prosedür uygulanırken, cihaz tasarımının oldukça esnek olduğu ve istenen hücre göçü derecesine ulaşmak için mikrokanal boyutlarının manipüle edilebileceği unutulmamalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz hücreleri kültüre etmek için uygun, özgün bir bölmelendirme mikroakışkan cihazının nasıl oluşturulacağını ve ardından bu prosedürü takip ederek hücrelerin göç karakteristiklerini kalitatif ve kantitatif olarak tanımlamak için uzun süreli zaman aşımı görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.

Yüksek göç kapasiteli kanser hücrelerinin genetik olarak ne kadar farklı olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için yeni nesil dizileme veya DNA mikroarray gibi diğer yöntemler uygulanabilir.