Fare Beyin-Omurilik Örneklerinin Ekstraksiyonu ve Doku Temizleme Hazırlanması

Araştırmamız, merkezi sinir sisteminin bilişsel işlevlere nasıl aracılık ettiğine ve bağışıklık sistemi ile nasıl etkileşime girdiğine odaklanmaktadır. Beyin ve omuriliği inceleme yöntemlerini geliştirmeyi ve bu etkileşimlerle ilgili temel soruları ele almayı amaçlıyoruz. Bu yöntemler tüm beyni ve omuriliği sağlam tutar, bu da doku temizlemeyi kullanarak hücreyi daha ayrıntılı bir şekilde haritalamamıza yardımcı olur. Ayrıca, geleneksel kesit alma ve görüntüleme yöntemlerine kıyasla süreyi ve hataları azaltarak süreci daha hızlı ve daha doğru hale getirir.

Beyin ve akciğerlere bağlı omurilik bölgelerinin haritasını çıkardık. Araştırmamız beyin, omurilik ve akciğerler arasındaki nöro bağışıklık iletişimini keşfetmeye odaklanacak. Ve bu etkileşimin bağışıklık tepkilerini nasıl etkilediği.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, farenin uzuvlarını çelik kelepçeler kullanarak geniş akrilik levhaya sabitleyin. Makas kullanarak iki uyluk kemiği arasındaki cildi kesin ve diyaframa ulaşana kadar yukarı doğru kesmeye devam edin. Kalbi ortaya çıkarmak için makas ve düz forseps kullanarak toraksın her iki tarafını diyaframdan açın. Sol ventriküle bir perfüzyon tüpüne bağlı 0.7 milimetrelik bir infüzyon iğnesi yerleştirin ve sağ atriyal apendikste bir ila iki milimetrelik bir kesi yapın. Perfüzyondan sonra, oftalmik makas kullanarak farenin arkasındaki ve başındaki cildi ayırın. Omurgayı, her iki uzvun üst arka kenarlarını birleştiren çizginin vertebral kolonla kesiştiği noktada kesin. Omurgayı ve kafatasını ortaya çıkarmak için farenin boynundan ve sırtından kas ve yağ dokusunu çıkarın. Venöz makasla, omurganın sol ve sağ tarafları ile omurilik arasındaki orta hat boşluğunu vertebral kanalın alt ucundan kesin. Daha sonra omuriliği ortaya çıkarmak için kopmuş omurganın üst kısmını ve iki taraflı taraflarını çıkarın. Beyin bağlantısına ulaşana kadar adımları tekrarlayın. Venöz makasın bir bıçağının ucunu foramen magnum ile beyin arasına yerleştirin. Kafatasını açmak için midsagital sütür boyunca kaydırın ve kesin. Kafatasını çıkarmak ve beyni ortaya çıkarmak için forseps kullanın. Şimdi, forseps ve venöz makas kullanarak, fare beyin omurilik dokusunu kafatası ucundan çıkarın. Stereo mikroskop altında omurilik zarını çıkarmak için diseksiyon forseps kullanın. Daha sonra, dikişlerle beyin omuriliği örneğini sabitleme plakasına sabitleyin. %4 paraformaldehitin numune hacminin en az 20 katını ekleyin. Fiksasyondan sonra paraformaldehiti atın ve numuneyi PBS ile üç kez yıkayın. Başlamak için, çıkarılan fare beyni omuriliğini paraformaldehit içinde sabitleyin. Lipid giderme çözeltisi için, çözelti A ve B'yi dokuza bir kütle oranında karıştırın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 50 mililitre lipit giderme solüsyonu ekleyin ve sabit dokuyu içine yerleştirin. Çözelti C'de inkübasyondan sonra, çözeltiyi değiştirin ve kültür kabını, numune çözelti C'ye tamamen daldırılmış durumda, ölçek çizgisine sahip bir ışık kutusu üzerine yerleştirin. Jel çözeltisi hazırlamak için, 200 mililitrelik bir cam şişeye 147 gram C çözeltisi ve üç gram agaroz ekleyin. Bileşenleri bir karıştırma çubuğuyla iyice karıştırın, ardından agaroz eriyene kadar mikrodalgada pişirin. Jel çözeltisini 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir laboratuvar fırınına aktarın. Kalıba iki milimetre derinliğinde 37 santigrat derece temperlenmiş jel çözeltisi tabakası dökün ve yarı katı olana kadar dört santigrat derece buzdolabında 30 dakika soğutun. Kırılma indisi ile eşleşen numuneyi kalıba yerleştirin ve numunenin üst kısmına veya seviyesine kadar veya biraz altına jel solüsyonu ekleyin. Kalıbı iki saat boyunca dört santigrat derece buzdolabına geri koyun. Bir kapak fişi ile örtün ve tekrar soğutun. Kapak fişini cımbızla çıkarın ve gömülü numuneyi çıkarın. 50 mililitrelik bir tüpe 30 mililitre görüntüleme solüsyonu ekleyin ve numuneyi solüsyona batırın. Tutucuyu görüntüleme cihazına sabitlemeden önce, numuneyi numune tutucuya sıkıca yapıştırmak için 502 yapıştırıcı uygulayın. Tarama yazılımını çalıştırın ve büyütme bölümünde 4X büyütme seviyesini seçin. Kalibrasyon modunu etkinleştirmek için kalibrasyon düğmesine tıklayın. Önizleme moduna girmek için önizleme düğmesine tıklayın. Ardından, oluşturulan ışık tabakası numuneden geçene kadar numuneyi numune odasının altından yavaşça yukarı doğru hareket ettirmek için Z yönü hareket düğmesine tıklayın. Uygun lazer kanalını ve aydınlatma modu seçeneğini seçin. Örnek için tarama yolu yönünü seçin. Örneğin görüntülerini yakalamaya başlamak için otomatik tarama düğmesine tıklayın. Protokol, net görüntüleme için bozulmamış floresan sinyallerini korurken tüm fare beynini ve omuriliğini başarıyla korudu. Beyin omurilik örneğinin floresan görüntülemesi, ayrıntılı nöral yapıları net bir şekilde görselleştirdi. Daha yüksek büyütme görüntüleri, tek tek floresan etiketli hücrelerin gelişmiş görselleştirmesini sağladı.