MODS tüberküloz tanısı için yöntem ve dirençli tüberküloz ilaca

Dünyadaki her üç kişiden biri tüberküloz enfeksiyonuna yakalanmıştır. Aktif tüberkülozun teşhis edilmesi yeni enfeksiyonları önler çünkü aktif tüberkülozu olan hastalar, tedavi edilene veya hayatını kaybedene kadar yılda 10 ile 15 arasında başka kişiye enfeksiyon bulaştıracaktır. MODS, mikroskopik gözlem (microscopic observation) ve ilaç duyarlılık testi (drug susceptibility assay) ifadelerini sürekli tekrarlamamak için kullandığımız bir kısaltmadır; bu ismin verilme nedeni, metodoloji açıklandıkça belirginleşecektir.

Bu kısa videoda, tüberküloz ve çoklu ilaç dirençli tüberkülozun hızlı ve düşük maliyetli teşhisi için mods metodolojisini ana hatlarıyla açıklayacağız. Videoda metodoloji adım adım sunulacaktır. Sıvı kültürle çalışmanın biyogüvenlik etkilerini tartışacak ve ayrıca bu metodolojinin kullanımı için gerekli olan bazı önemli kalite güvence konularını açıklayacağız.

Mods testi, Peru'nun Lima kentindeki Kayana Üniversitesi'nde, Bob Gilman'ın laboratuvarında geliştirilmiştir. Bu çalışma, başlangıçta loose cavi tarafından yapılan gözlemleri takip etmiştir. LOOSE, kolorimetrik indikatörler kullanarak kültürlerde mycobacterium tuberculosis'i tespit etmenin hızlı yollarını belirlemeye çalışıyordu.

Ancak, bu kültürlerin mikroskop altında incelenmesinin, kolorimetrik indikatörler renk değiştirmeden birkaç gün önce mikrobakteri büyümesinin varlığını ortaya çıkardığını belirtti ve MOD testi bu gözleme dayanarak geliştirildi. MOD testi, kaynakların sınırlı olduğu bir ortamda geliştirilmiştir ve yine kaynakların sınırlı olduğu ortamları hedeflemektedir; bu nedenle, TB'nin sıvı kültür tabanlı tespiti ve çoklu ilaç direncinin tespiti için test başına maliyet 3 doların hemen altındadır. Bu durum son derece caziptir ve ilk kez bu tür bir tanı kapasitesini kaynakların kısıtlı olduğu bölgelere taşımaktadır.

MGIT testi üç temel prensibe dayanmaktadır. Birincisi, mycobacterium tuberculosis'in sıvı besiyerinde katı besiyerine göre çok daha hızlı büyümesidir. Bu, uzun yıllardır bilinen bir gerçektir.

İkincisi, bu sıvı besiyerlerini mikroskop altında gözlemlediğimizde, M. tuberculosis gelişimini katı besiyerlerindeki kolonilerin makroskobik görünümünü beklemekten çok daha hızlı bir şekilde tespit edebiliriz. Ve gerçekten de bu gelişim tamamen karakteristik olduğundan, sıvı besiyerindeki M. tuberculosis'i bakteri veya mantar kontaminasyonundan ya da mevcut olabilecek atipik tüberküloz dışı mikobakterilerin gelişiminden ayırt edebiliriz. Son olarak ve belki de MGYT analizinin en heyecan verici yanı, rifampisin gibi ilaçları ve dolayısıyla çoklu ilaç direncini doğrudan balgam örneğine dahil edebilmemizdir.

Bu ilaçların assay'in başlangıcında kullanılmasıyla, hem tüberkülozun tespitini yapabilir hem de aynı zamanda izolatın bu iki ilaca dirençli olup olmadığını belirleyebiliriz. Bu durum, alt kültür oluşturma ve dolaylı bir ilaç duyarlılık testi hazırlama gereksinimini ortadan kaldırır. Şimdi, mods assay'ini gerçekleştirmek için gerekli olan ekipmanları özetleyeceğiz.

Hazırlanan besiyerlerini saklamak için bir buzdolabı gereklidir. Besiyerlerini ve Rifampin'i tartmak için bir terazi gereklidir. Balgamın karıştırılması için bir vorteks gereklidir.

Dekontaminasyon çözeltisi ile birlikte, dekontamine edilmiş balgam örneğini konsantre etmek için 3000 G'ye ulaşabilen bir santrifüj gereklidir. Santrifüjün soğutmalı olması gerekmez, ancak biyolojik olarak güvenli olması ve biyogüvenlik standartlarına uygun olması kesinlikle esastır. Mikobakteriyel çalışmalar için santrifüj kovalarının kilitlenebilir kapaklarla sızdırmaz hale getirilebilmesi gerekir. 37 °C'ye ulaşabilen ve bu sıcaklığı koruyabilen bir inkübatör gereklidir.

Bunun CO2 ile zenginleştirilmesine gerek yoktur. Mod plakalarını okumak için 4x ve 10x objektiflere sahip bir ters mikroskop gereklidir; ayrıca besiyerlerini sterilize etmek ve mikrobakteriyel kültürlerin imhası için bir otoklav gereklidir; besiyerlerine alikotlama yapmak için mikropipetler ve bir biyolojik güvenlik kabini gereklidir. Balgam örneklerinin manipülasyonunu ve plakaların inokülasyonunu içeren prosedürler için sınıf iki kabin gereklidir.

Mods assay'ini gerçekleştirmek için gerekli olan reaktifler şunlardır: Middlebrook 7H9 besiyeri kaskiyonu ve gliserol, antibiyotik takviyesi olan Panta ve OADC besleyici takviyesi. Antibiyotik stokları Rifampin ve rifampisin hazırlama için dimetil sülfoksit (DMSO), balgam dekontaminasyonu için sodyum hidroksit, sodyum sitrat ve N-asetil-L-sistein, fosfat tamponu hazırlama için disodyum fosfat ve monopotasyum fosfat, enfekte atıkların imhası için %10 sodyum hipoklorit ve çalışma yüzeylerinin temizliği için dezenfektan. Ayrıca şu plastikler ve sarf malzemeleri de gereklidir: steril cam tüpler, sulu çözücüler için 0,2 µm filtreler ve organik çözücüler için 0,2 µm filtreler, mikrosantrifüj tüpleri, 15 mL santrifüj tüpleri, steril 50 mL ve 10 mL serolojik pipetler, steril mikropipet uçları, 24 kuyucuklu doku kültürü tipi plakalar ve balgam örneği besiyerine inoküle edildikten sonra 24 kuyucuklu plakaların yerleştirildiği kilitlenebilir Ziploc tipi naylon torbalar.

Önceden hazırlanabilecek dört grup stok çözelti bulunmaktadır. Fosfat tampon çözeltisi, pH değeri 6,8 ± 0,2'ye ayarlanmış sodyum fosfat dibazik ve potasyum fosfat monobazik çözeltilerin kombinasyonundan oluşur. Bu çözelti, sterilizasyon amacıyla 121 ile 124 °C arasında 15 dakika boyunca otoklavlanır ve sterilitenin doğrulanması için bir alikotu besiyeri agarında kültüre edilir.

Bu, buzdolabında 2 ile 8 °C arasında bir aya kadar saklanabilir. Her bir balgam örneği için 10 mL Fosfat tampon çözeltisi gereklidir. Balgam dekontaminasyonu için kullanılan stok çözelti, sodyum hidroksit ve sodyum sitrat kombinasyonudur.

Bu çözeltiler eşit hacimlerde birleştirilir, 121 ila 124 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlanır ve ayrıca iki ila sekiz °C'de buzdolabında bir aya kadar saklanabilir. Her bir balgam örneği için bu çözeltiden iki mL gereklidir. Temel kültür ortamı, kazein ve gliserol içeren Middlebrook 7H9'dan oluşur.

Seven H nine tozu, gliserol ve kazein içeren steril distile su içerisinde çözülür ve tamamen çözünene kadar sürekli karıştırılır. Bu besiyeri 121 ila 124 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlanır ve soğutulduktan sonra steril 16 x 100 mm cam tüplere 4,5 mL'lik porsiyonlar halinde bölünür. Sterilitenin doğrulanması için besiyeri 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edilir; bu süre sonunda bulanıklık oluşmaması sterilitenin göstergesidir. Hazırlanan besiyeri, kapağı sıkıca kapatılmış şekilde 2 ila 8 °C'de bir aya kadar saklanabilir.

Her bir balgam örneği için bu kültürden 4,5 mililitre içeren bir tüp gereklidir. Besiyeri antibiyotik stok çözeltileri şu şekilde hazırlanır: steril distile su içinde tamamen çözülür ve sulu çözücüler için 0,2 mikrometre şırınga filtresi ile filtrelenir. Ardından, 20 mikrolitrelik alikotlar steril mikro santrifüj tüplerinde -20 °C'de altı aya kadar saklanabilir; her bir 20 mikrolitrelik alikot yüz örneğe kadar yeterlidir.

Sekiz mg/mL'lik rifampin stok çözeltileri, rifampisin DMSO ve steril distile su içerisinde çözülmesiyle hazırlanır. Bu karışım, organik çözücüler için uygun 0,2 µm'lik bir şırınga filtresi ile filtrelenir ve çözelti, steril mikrosantrifüj tüplerinde 20 µL'lik alikotlar halinde -20 °C'de altı aya kadar saklanabilir; her 20 µL'lik alikot 100 örneğe kadar yeterlidir. Şimdi metodolojinin kendisine ve prosedür gününde uygulamanız gereken üç adıma geçiyoruz.

Bu işlem, stok çözeltilerin çalışma çözeltilerine dönüştürülmesini kapsamaktadır. Önce dekontaminasyon çözeltisini, ardından besiyeri çözeltisini hazırlıyoruz. Son olarak, isen ve Rifampin ilaçlarının çalışma çözeltilerini hazırlıyoruz.

MODS metodolojisi için kullanılan dekontaminasyon yöntemi, standardize sodyum hidroksit NALC dekontaminasyon metodolojisidir. NALC, balgamın sindirilmesine yardımcı olan ve sodyum hidroksitin dekontaminasyonu gerçekleştirmesini sağlayan bir mukolitiktir. Bunun için, sodyum hidroksit sodyum sitrat stok çözeltisine ihtiyaç vardır ve bu çözeltinin 20 ml'sine 0,1 gram NA eklenir.

Hazırlama gününde kullanılmayan tüm solüsyonlar atılmalıdır. Kültür ortamının nihai hazırlığı da yalnızca kullanım gününde yapılmalıdır. Saklanan seven H nine ortamı OADC ve panta ile birleştirilir; her tüpte 4.5 milliliters ortam, 0.5 milliliters OADC ve 0.1 milliliters Panta birleştirilir.

Bu miktar bir örnek için yeterlidir. Her bir ilacın çalışma çözeltileri kullanım gününde hazırlanır ve kullanılmayan çözeltiler, aktivite garanti edilemeyeceği için atılmalıdır; saklanan alikotlar, balgam örneği ve besiyeri eklendikten sonra ulaşılan nihai kuyucuk konsantrasyonu folik asit için 0,4 µg/mL ve Rifampin için 1 µg/mL olacak şekilde 24 kuyucuklu doku kültürü plaklarında 7H9 OADC besiyeri ile seri olarak seyreltilir.

Şimdi Dekontaminasyon prosedürüne geçiyoruz; konik tabanlı bir Falcon tüpüne 2 mL balgam örneği yerleştirilir ve ardından 2 mL sodyum hidroksit bazlı Dekontaminasyon solüsyonu eklenir. Kapak kapatılıp sıkıca vidalandıktan sonra süspansiyon vorteksle karıştırılır ve dekontaminasyon işleminin gerçekleşmesi için 15 dakika boyunca bekletilir. Bu sürenin ardından 14 mL fosfat tampon çözeltisi eklenir.

Kapak geri takılıp sıkıca vidalanır ve tüp santrifüje yerleştirilir; 3000 G'de 50 dakika sonra, S süpernatanı dekante edilir ve geriye kalan pelet, 7H9 OEDC panter'in 5,1 mililitrelik tüplerini kullanarak ekimini yapmak istediğimiz örnektir. Peletimiz yaklaşık iki mililitrelik bir hacme resüspande edilir. Resüspande edilen bu örneğin yarısı, bir mikro santrifüj tüpünde yedek olarak saklanır.

Bu, kültürümüz kontamine olursa ve örneği tekrar ekmemiz gerekirse kullanılmak üzere hazır bulundurulur. Diğer mililitre, cam tüpümüzdeki kalan yedi H nine oh a DC panter'e eklenir ve böylece ekime hazır örneğimiz oluşmuş olur. Bu medya ve örnek süspansiyonundan 900 µL, 24 kuyucuklu bir plakanın bir sütunundaki dört kuyucuğun her birine yerleştirilir.

24 kuyucuklu plakanın geri kalan kuyucukları, beş sütunun her birine bir tane gelecek şekilde toplam beş örnekle doldurulur ve altıncı sütun numunesiz bırakılır. Altıncı sütun, negatif kontrol olarak hizmet eder. Bu sütuna, balgam örneği hariç tüm besiyeri bileşenleri eklenir ve bu sütundaki herhangi bir üreme, çapraz kontaminasyon sorunu olduğunu açıkça gösterir; bu durumda plakanın tamamı atılmalıdır.

Çalıştırdığımız her plaka için bir negatif kontrol sütunu gereklidir. Şu anda tüm örneklerimizi ve besiyerimizi içeren plakamız hazır. Şimdi, antibiyotik süspansiyonlarını ayrı bir plakaya eklememiz gerekiyor.

Rifampin ve Isid dilüsyonlarını daha önce açıklandığı şekilde hazırladık ve dört kanallı bir çoklu pipet kullanarak bu kuyucukların her birinden 100 µL topladık; iki kontrol kuyucuğunun her birine 100 µL 7H9 OADC, ilaç içeren iki kuyucuğun her birine ise 100 µL Rifampin ve 100 µL isid ekledik. Plaka tamamlandığında kapağı kapatıldı ve bir Ziploc torbanın içine yerleştirildi. Bu noktadan sonra torba bir daha açılmaz ve böylece sıvı besiyerinde büyüyen kültürlerin torbadan dışarı çıkma ihtimali ortadan kaldırılmış olur.

Bundan sonra plakanın tüm okumaları torba içerisinde gerçekleştirilir ve torba, bir otoklav torbasına yerleştirilerek kültür sonunda atılır. Bu şekilde, yüksek konsantrasyonlu mikobakteri süspansiyonlarının manipülasyonundan kaçınmış oluruz. Şimdi kalite kontrol hakkında birkaç söz söyleyeceğiz.

mods metodolojisinde, analizinin doğru şekilde uygulanması için temel teşkil eden yerleşik kalite kontrolleri bulunmaktadır. Öncelikle, her bir plak üzerinde çalıştırılan negatif kontroller mevcuttur. Bunlardan daha önce bahsedilmiştir ancak özetle; bir plak üzerinde beş adet balgam örneğinin yanında, balgam örneği içermeyen ancak tüm besiyeri bileşenlerini barındıran bir sütunumuz vardır. Bu sütundaki kuyucuklar, diğer tüm kuyucuklar gibi incelenmelidir ve bu kuyucuklarda herhangi bir üremenin görülmesi, çapraz kontaminasyon meydana geldiğini ve dolayısıyla plaktaki sonuçların hiçbirine güvenilemeyeceğini gösterir.

Bu nedenle plaka atılmalı ve tüm örnekler yeniden plakalanmalıdır. Ayrıca, pozitif kontroller olan dahili kontroller bulunmaktadır. Laboratuvar içindeki çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek için bu kontroller ayrı bir plakada yürütülür ve bu plaka, gün sonunda diğer tüm örnek plakaları hazırlandıktan sonra hazırlanır.

Bu ayrı plakta, tam duyarlı bir *Mycobacterium tuberculosis* suşu ile isid ve rifampisine dirençli bir suş çalıştırıyoruz. Bir plakta çoklu ilaç dirençli bir suş çalıştırmakla ilgili endişeler varsa, bu iki duyarlı ve MDR suşun yerine rifampin mono-dirençli bir suş ve is mono-dirençli bir suş çalıştırılabilir. Bu suşların amacı, sadece besiyerinin büyümeyi desteklediğini göstermek değil (bu nedenle tüm pozitif kontrollerimiz ilaçsız kuyucuklarda büyüme göstermelidir), aynı zamanda ilaç konsantrasyonlarımızın doğru olduğunu kanıtlamaktır; dolayısıyla duyarlı pozitif kontroller is ve rifampin varlığında büyümemeli, dirençli pozitif kontroller ise plakta bulunan rifampin ve is konsantrasyonlarına rağmen doğal olarak büyümelidir.

Tamam, şimdi plaka okumaya geçelim. Örnekleyicilerimizi plakalara ektiğimiz günü baz alırsak, sıfırıncı gün plaka okuması beşinci günde başlar. Bu süreden önce mikobakteriyel büyüme çok nadir görülür.

Plakalar, ters ışık mikroskobu altında incelenir. Yani plakalar aşağıdan yukarıya doğru incelenir ve bu durum kordların çok net bir şekilde görülmesini sağlar; kültürleri yukarıdan görüntüleme girişimi, plak kapaklarındaki yoğunlaşma nedeniyle zorlaşmaktadır ve ayrıca standart bir mikroskobun odak uzaklığı yetersizdir. Mikroskobik inceleme genellikle 10 x objektif ile gerçekleştirilir; her iki ilaçsız kuyucukta en az iki koloni oluşturan birim bulunan kültürler pozitif olarak kabul edilir.

Besiyeri bulanıklaştığı ve beşinci güne gelindiğinde genellikle kuyucuğun çoğunda aşırı üreme olduğu için kontaminasyon varlığı kolayca fark edilir. Buna karşın, mikobakteri büyümesi kuyucuğun bulanıklaşmasına yol açmaz; mikobakterilerin ilk büyümesi küçük virgül benzeri formlar oluşturur ve bunlar zamanla karakteristik kordlar veya yumaklar oluşturacak şekilde ilerler. İki hafta içinde, güçlü pozitif büyümede, kordların yalnızca uç kısımlarda gerçekten görünür olduğu mikobakteri konglomerasyonları oluşmuş olacaktır.

Pozitifleşecek kültürlerin büyük çoğunluğu 14. güne kadar pozitifleştiğinden, beşinci günden 14. güne kadar günlük okumalar, sonrasında ise laboratuvar iş yüküne göre her iki veya üç günde bir okumalar yapılması önerilir. İlaçsız iki kuyucukta kültürün açıkça pozitif olduğu gün, ilaç içeren kuyucuklar okunmalıdır. Herhangi bir ilacın varlığındaki herhangi bir üreme, o ilaca karşı direnç olduğunu gösterir. İlaç içeren kuyucukların okumasının, ilaçsız kuyucuklarda pozitif kültür saptandıktan bir haftadan daha uzun bir süre sonra yapılması durumunda, ara sıra görülen atılım büyümesi (breakthrough growth) nedeniyle bunun direnci temsil etmeyebileceğini not etmek çok önemlidir.

Bir kültür negatifse okumalar 21. günde durdurulabilir, çünkü tedavi almayan hastalarda bu süreden sonra pozitif kültürlerle asla karşılaşılmaz. 21 günlük inkübasyon tamamlandığında kültürler atılabilir. Kültürler Ziploc torbalarının içinde tutulur, ardından otoklav torbalarına yerleştirilir ve 121 ila 124 degrees centigrade sıcaklıkta 45 ila 60 dakika boyunca otoklavlanır; bunun ardından güvenle atılabilirler. Şimdi, MODS testini sadece Peru'da değil, aynı zamanda Afrika ve Asya'daki ortamlarda da yaygınlaştırdığımız için biyogüvenlik ve MODS testi hakkında birkaç söz söyleyeceğim.

Sıvı ortamlarda mikrobakteriyel kültürlerin kullanımının güvenliği ve biyogüvenliği hakkında tekrarlayan bir soru ortaya çıkmaktadır. Sıvıların dökülme ihtimalinin olması ve katı ortamların bu riski taşımaması, ayrıca mikobakteri süspansiyonlarıyla çalışırken aerosol oluşma riskinin bulunması nedeniyle bu endişe anlaşılabilir bir durumdur. Aslında, mod metodolojisinin, dolaylı ilaç duyarlılık testi gerektiren herhangi bir metodolojiden daha güvenli bir metodoloji olduğuna inanmamızın nedeni tam da bu sebeplerdir.

Bunun nedeni, indirekt duyarlılık testi için bilinen konsantrasyonda bir mikrobakteri süspansiyonunun hazırlanmasıdır. Bu durum, beraberinde dökülme ve aerosol oluşumu risklerini getiren yüksek konsantrasyonlu mikrobakteri çözeltilerinin manipülasyonunu gerektirir. Buna karşılık, az önce gördüğünüz mods metodolojisi, basitçe bir balgam örneğinin plakamıza inokülasyonunu içerir ve ardından plak kilitli bir plastik torba içinde mühürlenir.

Bu torba bir daha asla açılmaz ve bu sayede yüksek konsantrasyonlu süspansiyonlarla uğraşmak zorunda kalmayız. Bu durum, mod metodolojisinin tamamen güvenli olduğuna inandığımız anlamına gelmez; mikobakterilerin taşınması her zaman bir risk taşır. Ancak, 2006 yılında Kore'de yayınlanan veriler, mod yönteminin herhangi bir başka kültürü ekim yapmaktan daha tehlikeli olmadığı yönündeki görüşümüzü doğrular niteliktedir.

Laboratuvar çalışanları üzerinde yürütülen bu çalışma, sadece kültür ekimi yapan ve ilaç duyarlılık testi sorumluluğu bulunmayan laboratuvar çalışanlarının maruz kaldığı mesleki risklerin, balgam smear mikroskopisi yapanlarınkiyle aynı düzeyde olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, mikobakteri süspansiyonları ile çalışan ve ilaç duyarlılık testi yapanlarda tüberküloz için mesleki risk oranları çok daha yüksektir. Açıkçası, tüm laboratuvar personelinin mümkün olan en yüksek düzeyde korunması büyük önem taşımaktadır; bu nedenle, N95 standart maskelerle kastettiğimiz uygun kişisel solunum koruması olmadan bu prosedürlerin hiçbirinin uygulanmamasını şiddetle tavsiye ederiz.

Ek olarak, tüm egzoz alanlarının HEPA filtrelerinden geçirildiği sınıf iki bir biyolojik güvenlik kabini veya davlumbaz gereklidir. Son olarak, bir laboratuvar içindeki hava akışı türbülansını önlemede çok önemli olan basit bir mekanizma, örnekler işlenirken personelin giriş çıkışını engellemek için laboratuvar kapısına takılan bir kilittir. Bu, laboratuvar içi bulaşma riskini azaltır. Böylece, MODS metodolojisinin neleri kapsadığı ve kaynakların sınırlı olduğu ancak yüksek kaliteli TB ve MDR TB tanılarına acilen ihtiyaç duyulan ortamlarda ne kadar faydalı olabileceği konusunda size iyi bir genel bakış sunmuş olduğumu umuyorum.

Daha fazla bilgi için, ayrıntılı standart çalışma prosedürlerimizi ve MODS kullanıcı kılavuzunu bulabileceğiniz mods peru. org web sitemizi ziyaret edebilirsiniz. Ekstrpulmoner örneklerin işlenmesine yönelik SOP'lerin yanı sıra, mycobacterium ve tüberküloz, diğer mycobacteria ile bakteriyel ve fungal kontaminasyonlara ait bir fotoğraf kütüphanemizin yanı sıra, kalite güvence stratejimizi ve laboratuvarların MODS kullanmaya başlaması için önerdiğimiz akreditasyon prosedürünü de burada bulabilirsiniz.

Son olarak, sıkça sorulan sorular sayfası mevcuttur ve bu iteratif bir metodoloji olduğu için şu an modları kullanan kullanıcılardan gelecek her türlü geri bildirime açığız. Daha önce açıkladığımız gibi, bu tescillenmemiş bir testtir ve diğer laboratuvarların gerçekleştirmeyi başardığı iyileştirmelerle her zaman ilgileniyoruz.