من التركيبات لبلورات - نحو تحديد هيكل β برميل الخارجي بروتينات الغشاء

الهدف العام من هذه الطريقة هو الحصول على كميات مليغرام من بروتينات بيتا برميل الغشاء الخارجي التي سوف تتبلور وتنكسر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال طي ونقل البروتين الغشائي ، مثل كيفية إدخال بروتينات برميل بيتا في أغشية الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قوية لبروتينات بيتا برميل.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، لأن اختيار المنظفات للتنقية والتبلور والانكسار يمثل تحديا. سيقوم جيريمي غيرين ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبر سوزان بوكانان ، بعرض الإجراء ، بالإضافة إلى وزملائي في المختبر. ابدأ هذا الإجراء ببناء متجه تعبير T7 يحتوي على بروتين الغشاء الخارجي المستهدف المحسن للكودون ، أو جين OMP ، للتعبير في الجسم الحي إلى الغشاء كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بتحويل البناء إلى سلالة تعبيرية عن البكتيريا للتعبير عن طريق سحب ميكرولتر واحد من البلازميد إلى 50 ميكرولترا من الخلايا المختصة كيميائيا BL21 (DE3) ، واخلطها برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بالنبض الحراري عند 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية باستخدام حمام مائي ، ثم ضعه مرة أخرى على الجليد لمدة دقيقة واحدة.

أضف ملليلترا واحدا من وسائط SOC المسخنة مسبقا ورجها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة عند 1000 دورة في الدقيقة باستخدام حاضنة شاكر على مقاعد البدلاء. بعد الحضانة ، قم بوضع 100 ميكرولتر من الخلايا على ألواح LB Agar التي تحتوي على مضاد حيوي مناسب وتحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، مقلوبة. بعد ذلك ، قم بإجراء اختبارات تعبير صغيرة عن طريق تلقيح خمسة ملليلتر من مزرعة المضادات الحيوية المحتوية على LB بمستعمرة واحدة.

كرر لمدة خمس إلى 10 مستعمرات. تنمو عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من الصفر نقطة ستة تقريبا. قم بتحفيز التعبير عن OMP المستهدف عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من IPTG مولاري واحد إلى كل أنبوب استزراع والسماح بالنمو لمدة ساعة إلى ساعتين إضافيتين.

لمقارنة مستويات التعبير لجميع المستعمرات ، قم بعمل طرد مركزي واحد من كل مزرعة لمدة دقيقة واحدة عند 15،000 مرة G، باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل 1X SDS-PAGE. يسخن على حرارة 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 15،000 مرة جم لمدة خمس دقائق.

قم بتحليل العينات باستخدام SDS-PAGE عن طريق سحب 20 ميكرولترا في كل بئر من هلام بنسبة عشرة بالمائة. قم بتشغيل الجل لمدة 35 دقيقة عند 200 فولت ثابت. أخيرا ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 6000 مرة جم لمدة عشر دقائق.

أعد تعليق الخلايا في مخزن التحلل بنسبة خمسة ملليلتر لكل جرام من معجون الخلايا. قم بتحليل الخلايا باستخدام مكبس فرنسي أو خالط الخلية. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا المحللة عند 15،000 مرة جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة الخلايا غير المحللة وحطام الخلايا.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف وجهاز طرد مركزي مرة أخرى بسرعة عالية لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية. الحبيبات الناتجة هي جزء الغشاء الذي يحتوي على البروتين المهم. باستخدام الخالط Dounce ، أعد تعليق جزء الغشاء.

أولا ، قم بنقل الأغشية ثم أضف مخزن الذوبان بتركيز 2X بدون منظف. صب الأغشية المعلقة في أسطوانة متدرجة وأضف الماء حتى يتم الوصول إلى التركيز النهائي للذوبان 1X. انقل العينة إلى دورق وأضف المنظف ببطء إلى تركيز نهائي يبلغ حوالي 10 أضعاف تركيز المذيلات الحرج.

ثم حركه لمدة 0.5 إلى 16 ساعة عند أربع درجات مئوية ، اعتمادا على مدى سهولة استخراج البروتين المستهدف من الأغشية. أخيرا ، قم بالطرد المركزي للعينة القابلة للذوبان عند 300 ، 000 مرة G لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. قم بإعداد عمود IMAC من واحد إلى خمسة ملليلتر أو استخدم عمودا معبأا مسبقا.

قم بإجراء خطوات الكروماتوغرافيا اللاحقة عند أربع درجات مئوية. اشطفها بالماء لإزالة أي آثار للمواد الحافظة. إذا كنت تستخدم نظام تنقية آلي ، فقم بتثبيت العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

تحضير 500 مل من المخزن المؤقت IMAC A بدون إيميديزول و 250 مل من المخزن المؤقت IMAC B مع إيميديزول مولاري واحد. قم بموازنة عمود IMAC باستخدام 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت IMAC A.أضف إيميديزول إلى عينة البروتين إلى تركيز نهائي يبلغ 25 ملليمولار واخلطه. بعد ذلك، قم بتحميل العينة على عمود IMAC المتوازن بمعدل ملليلترين في الدقيقة.

اجمع التدفق. بعد ذلك ، اغسل عمود IMAC بخمسة أحجام أعمدة لكل منها تركيزات متزايدة من الإيميديزول ، باستخدام المخزن المؤقت B.اجمع الغسالات في جزأين من المليلتر. قم بمسح العينة بتركيز نهائي قدره 250 مليمولار لخمسة أحجام أعمدة واجمع العينة المملوطة في جزأين مليلتر.

قم بتحليل التدفق وأجزاء الغسيل وكسور الشطف باستخدام تحليل SDS-PAGE بناء على امتصاصها عند 280 نانومتر. تجميع الكسور التي تحتوي على OMP لبرميل بيتا المستهدف كما تم التحقق منه بواسطة تحليل SDS-PAGE. بعد ذلك ، قم بإزالة علامة الهيستادين 6X عن طريق إضافة بروتياز TEV إلى العينة المجمعة واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف.

قم بتحميل محلول البروتياز العينة على عمود IMAC مرة أخرى لفصل OMP لبرميل بيتا المستهدف عن العلامات المشقوقة وأي عينة غير مشقوقة. سيحتوي التدفق على العينة المشقوقة التي تفتقر إلى العلامة. للتحضير للتبلور ، قم بتحميل العينة على عمود ترشيح هلام في مخزن مؤقت يحتوي على المنظف لاستخدامه في التبلور.

اجمع كسور مليلتر واحدة وقم بتحليلها باستخدام تحليل SDS-PAGE بناء على امتصاصها عند 280 نانومتر. قم بتجميع تلك الأجزاء التي تحتوي على البروتين المستهدف ، ثم ركز على حوالي 10 ملليغرام لكل ملليلتر. قبل تحضير العينات ، قم بتجميع جهاز الجل.

استخدم المخزن المؤقت للتشغيل الجل المبرد مسبقا أو قم بتشغيل الجل في الغرفة الباردة. قم بتصفية العينة باستخدام مرشح طرد مركزي 0.22 ميكرون لإزالة الجسيمات وهطول الأمطار. بعد ذلك، قم بإدخال 0.25 ميكرولتر من العينة في أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر.

قم بتسمية أحدهما على أنه مسلوق "والآخر على أنه RT" بعد ذلك ، أضف 9.75 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة إلى كل أنبوب واخلطه عن طريق سحب العينات. إلى كلتا العينتين، أضف أيضا 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحميل 2X SDS واخلطه برفق عن طريق سحب العينات. اغلي العينة المسلوقة على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، مع ترك عينة RT في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتدوير العينة المسلوقة لفترة وجيزة. بعد ذلك ، قم بتحميل 20 ميكرولترا من كلتا العينتين على الجل الأصلي المجمع مسبقا. بعد تشغيل الجل لمدة 60 دقيقة عند 150 فولت ثابتة ، قم بإزالة الجل وانقعه في محلول تلطيخ لتصور النتائج.

تابع تجارب التبلور في المنظفات والخلايا الثنائية والطور المكعب الدهني ، باستخدام طرق Jove المنشورة مسبقا. يتم تصور رؤوس التبلور تحت مجهر الأشعة فوق البنفسجية للتحقق من أن البلورات هي بالفعل بروتين ولم يتم حلها أو دهون أو منظفات. يتم فحص بلورات الرصاص باستخدام مصدر منزلي أو في السنكروترون لمعرفة ما إذا كانت البلورات تنكسر.

بعد جمع بيانات البلورات التي تنكسر جيدا ، قم بمعالجة البيانات باستخدام برامج المعالجة ، مثل HKL2000. انقل الملفات الناتجة إلى مجموعة برامج لتحديد الهيكل ، مثل Phoenix Suit ، وقم بإجراء الاستبدال الجزيئي للمراحل الأولية وتحديد الهيكل. تم تحديد التركيب البلوري ل YIUR بدقة 2.6 Angstrom باستخدام هذه الطريقة.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أسبوعين ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي البكتيرية وتنقيتها للدراسات الهيكلية.