إعادة تشغيل مباشرة من شوكة المتماثل المتوقفة من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي هيد اون

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة مصير منطقة التضاعف (Repli zone) وبوليميراز الحمض النووي الريبوزي (RNA polymerase) أو RNAP بعد حدوث تصادم وجهًا لوجه. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجميع معقد النسخ على DNA مُبَيوتَن (biotinylated DNA) وتثبيته على أقراص وخرز Stripp، مما سيؤدي إلى تكوين معقد استطالة RNAP متوقف. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ربط DNA متفرع مسبق التجهيز بمعقد استطالة RNAP لتكوين شوكة تضاعف في اتجاه المصب من RNAP المتصادم وجهًا لوجه.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تجميع منطقة التضاعف وبدء تخليق الشريط القائد عند شوكة التضاعف. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي عزل الـ DNA من الخرز المغناطيسي وتنقيتها باستخدام عمود تنقية الـ PCR. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر توقف الـ roso عند الاصطدام بمعقد النسخ المواجه من خلال هلام agarose قلوي لمنتجات الـ DNA المنقاة والموسومة إشعاعياً.

مرحباً، أنا ريتشارد بوميرانس من مختبر مايك أودونيل في جامعة روكفلر. سأعرض لكم اليوم إجراء كيفية إجراء تصادم للريبوسوم مع RNA polymerase وجهاً لوجه في الطور الصلب. أستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة كيفية تأثر عملية التضاعف بمعقدات النسخ على طول DNA.

لنبدأ الآن. لبدء هذا البروتوكول، اخلط إنزيم RNAP holo مع قالب DNA بطول 3.6 KB مُبيوتناً ويحتوي على المحفز T seven A one في 100 µL من المنظم a، ثم قم بحضن الخليط لمدة 10 دقائق عند 37 °C. بعد فترة الحضن التي تستغرق 10 دقائق، أضف ribonucleotides adenosine, tri phosphate و cytidine phosphate و Aden allele uridine، مما سيحد من تخليق RNA إلى 20 nucleotide.

قم بتحضين المحلول لمدة 10 دقائق إضافية عند 37 درجة Celsius لتثبيت معقد استطالة RN ape المتوقف على الخرزات. أضف المحلول إلى خرزات مغناطيسية مغلفة بالستربتافيدين. اترك الخليط ليتحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بتنقية معقد استطالة RNAP الموقوف والمثبت عن طريق غسل الخرز بـ 0.9 milliliters من منظم ملحي عالي التركيز. ولإزالة معقدات R-N-A-P-D-N-A غير النوعية بعد كل غسلة، قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الفصل المغناطيسي. يجب تكرار عملية الغسل هذه خمس مرات.

بعد ذلك، يجب غسل الخرزات مرتين إضافيتين باستخدام 0.9 milliliters من المنظم A. بعد الغسلة الأخيرة، يمكن تجميع شوكة التضاعف في اتجاه المصب لتكوين شوكة تضاعف في اتجاه المصب من RNAP الموجه عكسياً؛ قم بإعادة تعليق الشريط المغناطيسي لإظهار الخرزات الملتصقة بمعقد استطالة RNAP المتوقف في 100 microliters من New England Biolabs buffer four. بعد ذلك، أضف 10 units من shrimp alkaline phosphatase أو SAP one، واحضن العينة لمدة 10 minutes عند 37 degrees Celsius. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 0.9 milliliters من المنظم A. ثم أعد تعليق الخرزات في 50 microliters من quick T four ligation reaction buffer.

أضف 2 µL من T4 ligase السريع وDNA متشعب مسبق الحاجة، ثم حضن المحلول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أخيرًا، اغسل الخرزات ثلاث مرات إضافية باستخدام 0.9 mL من buffer A، واخلط hexamer وDNAB helicase مع strep A المغناطيسية والخرزات المرتبطة بمعقد استطالة RNAP المتوقف وشوكة التضاعف في الاتجاه السفلي. حضّر المحلول في 150 µL من buffer A وحضنه لمدة 30 ثانية عند 23 °C.

بعد فترة الحضانة القصيرة الثانية والثلاثين عند 23 درجة Celsius. إلى polymerase three beta clamp، أضف A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P وDGTP المسمى بـ alpha P 32 وDATP المسمى بـ alpha P 32 حتى يصل الحجم إلى 200 µL. تُحضن العينة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة Celsius.

ابدأ عملية التضاعف بإضافة البروتين المرتبط بالحمض النووي أحادي السلسلة DCTP و DTTP. أضف أيضاً DTTP و DCTP الموسومين بـ alpha P 32، ليصل الحجم النهائي إلى 250 microliters. بعد 10 دقائق، أوقف التفاعلات بإضافة 12 microliters من EDTA بتركيز 0.5 molar.

بعد ذلك، قم بغلي خرزات strp din لتحرير الـ DNA منها. تخلص من أي DNA متبقٍ عن طريق معالجة الخرزات بـ proteinase K لمدة 30 دقيقة عند 50 °C. قم بغلي الخرزات مرة أخرى وأزل الطافي باستخدام الفصل المغناطيسي.

قم بتنقية السائل الطافي المجمع الذي يحتوي على DNA باستخدام مجموعة Kyogen PCR cleanup. وأخيراً، قم بتحليل نواتج DNA المنقاة والموسومة إشعاعياً في هلام agarose قلوي. عادةً ما يؤدي تصادم المنطقة مع RNAP وجهاً لوجه إلى ظهور ناتجين بطول 2.5 KB و3.6 KB. يمثل الناتج الذي يبلغ طوله 2.5 KB طول DNA من الشوكة إلى RNAP المتوقف.

ينتج هذا عن توقف عملية التضاعف عند الاصطدام بـ RNAP. يمثل المنتج الذي يبلغ حجمه 3.6 KB الحمض النووي كامل الطول، وينتج إما عن عدم إشغال المحفز بالكامل بواسطة RNAP أو عن القراءة المتجاوزة الجزئية للتضاعف لـ RNAP في وضع المواجهة. وتظهر النتيجة الجيدة إنتاج ما يقرب من 50% من الحمض النووي كامل الطول.

ومع ذلك، في بعض الحالات، يحدث انشغال أقل للمُحفز بواسطة RNAP ويُلاحظ وجود نسبة أعلى من DNA كامل الطول. ويرجع ذلك إلى أن مجموعة أكبر من مناطق التضاعف لا تواجه تضاعفاً في مواجهة RNAP، حيث يؤدي غياب RNAP المتوقف إلى إنتاج DNA كامل الطول فقط. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء التضاعف والطور الصلب في وجود معقد استطالة RNA polymerase متوقف ومرتبط بـ DNA. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم غسل معقد النسخ المتوقف بملح عالي التركيز لإزالة RNA polymerase الزائد، الذي يرتبط بـ DNA بشكل غير محدد ويثبط عملية التضاعف.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.