التنميط بروتيوم الأكسدة والاختزال ثيول استخدام الطيف النظائر كتلة توصيف

الهدف العام من هذه التجربة هو ملاحظة تأثيرات بكتيريا pseudomona siro PV tomato على البروتينات المنظمة للأكسدة والاختزال في نباتات الطماطم. أولاً، يتم تلقيح نباتات الطماطم بـ pseudomona siro PV PV tomato لتحفيز العدوى الممرضة والاستجابة البروتينية. بعد ذلك، يتم التلوين باستخدام DIAM benzine لملاحظة التغيرات في أنواع الأكسجين التفاعلية.

بعد ذلك، قم بإجراء وسم TMT للسيستين من أجل فحص بقايا السيستين المنظمة بالأكسدة والاختزال في البروتينات. ويمكن للنتائج التي يتم الحصول عليها قياس التغيرات بين العينات المعالجة وعينات التحكم. مرحباً، أنا تشين من قسم البيولوجيا ومرفق البروتوميات هنا في جامعة فلوريدا.

تتمثل ميزة وسم CTMT الخاص بنا مقارنة بالطرق الحالية مثل وسم الزعانف المغطاة بالنظائر، والمعروف أيضاً باسم ASCA، في القدرة على إجراء التعددية (multiplexing) أثناء تحليل البروتينات المستجيبة للأكسدة والاختزال على نطاق واسع. وبينما سيوفر هذا العرض رؤى حول البروتينات المنظمة بالأكسدة والاختزال في الطماطم استجابةً للإصابة بمسببات الأمراض، يمكن تطبيق التجربة على أنظمة أخرى مثل joof، وفئران cu، ونباتات أخرى، والتحكم في الظروف المجهدة. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة بعد أن لاحظنا تبايناً ملحوظاً بين تجارب ICAD نظراً لتوفر وسمين فقط.

يعد عرض VIR لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم خطوات الوسم والإثراء. يجب تقليل التباينات التجريبية بين العينات الموُسّمة، كما يجب تقليل المناطق المزالة لضمان كفاءة الوسم، فلنبدأ. ازرع شتلتين من الطماطم المنقولة بحجم مماثل في أوانٍ يبلغ قطرها أربعة بوصات لاستزراع اللقاح.

نمو كثيف من بكتيريا pseudomona singe على طبق KBM. يتم كشط البكتيريا في 20 milliliters من الماء وتحضير لقاح بكتيري بتركيز يصل إلى 10⁶ colony forming units per milliliter تقريبًا. وفي لتر واحد من محلول التلقيح المنظم، تُغمر النباتات التي يبلغ عمرها أربعة أسابيع في محلول التلقيح البكتيري لمدة 30 ثانية.

ثم تُغطى فوراً بأكياس بلاستيكية شفافة. بعد وقت التلقيح المفضل، تُحصد الورقة المتمددة بالكامل وتوضع بحيث يكون الجانب البشرى للأعلى في صبغة DAB بتركيز 1 mg/mL، وتُخضع للترشيح الفراغي لمدة 15 دقيقة. ثم تُحضن الأوراق في الظلام في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

الآن، يتم غلي الأوراق المصبوغة في 95% ethanol لمدة 10 دقائق وتخزينها في 75% ethanol باستخدام هاون. تُطحن الأوراق التي تم جمعها إلى مسحوق ناعم في نيتروجين سائل. بعد ذلك، يتم إجراء استخلاصات الفينول كما هو موضح في النص المصاحب.

بعد ذلك، يتم ترسيب البروتينات المستخلصة بالفينول باستخدام خمسة أضعاف الحجم من أسيتات الأمونيوم بتركيز 0.1 molar الباردة في 100%methanol. تُجمع البروتينات عن طريق الطرد المركزي، ثم تُجرى عمليات غسل للراسب. بعد ذلك، تُعاد معالقة العينات في 1.5 milliliters من 70%ethanol البارد، وتُنقل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 milliliters.

بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي من الإيثانول وجفف الراسب لفترة وجيزة في جهاز التجفيف بالتفريغ السريع (speed vac)، ثم أذب العينات في محلول استخلاص البروتين الممسخ. بعد إجراء الطرد المركزي لتكوين الراسب، اجمع السائل الطافي وقم بقياس تركيز البروتين وفقاً لدليل الشركة المصنعة. لكل من علامات الكتلة الست، ابدأ بـ 100 µg من عينة البروتين مع حجم مساوٍ من محلول alkylation buffer بتركيز 200 mM من IO acetamide المُحضّر حديثاً لغلق مجموعات الثيول الحرة، ثم حضن العينات عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، ولترسيب البروتينات، أضف 1 mL من الأسيتون البارد بتركيز 80% وضع العينات في درجة حرارة -20 °C طوال الليل.

يتم تجميع البروتين في شكل قرص عن طريق الطرد المركزي، ثم يُغسل ثلاث مرات باستخدام 80%acetone. وبعد تجفيف العينات في الهواء على الثلج، يُعاد تعليق القرص في 50 µL من محلول التحلل (lysis buffer). ولتقليل روابط الديسلفيد، يُضاف 0.5 µL من 100 mM TCEP ويُحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

قم بإذابة العلامات عن طريق إضافة 20 µL من الأسيتونتريل إلى أنابيب الكاشف. استخدم جهاز الرج الميكانيكي (Vortex) ثم قم بالطرد المركزي لترسيب السائل. بعد ذلك، ولإزالة TCEP الزائد، قم بتحميل 50 µL من العينة على عمود MicroCon 3 KD. أضف 50 µL من محلول التحلل المنظم (lysis buffer) وقم بالطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 10,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C.

لجمع العينة، قم بإزالة العمود وقلبه داخل أنبوب نظيف ثم استخدم جهاز الطرد المركزي. افحص الرقم الهيدروجيني (pH) للعينة إذا لزم الأمر. قم بضبط الرقم الهيدروجيني ليكون بين pH 7 و pH 8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك بتركيز 1 molar.

أضف 5 µL من كاشف TMT للتكيسات واترك التفاعل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، ثم ادمج العينات وأضف حجماً مساوياً من منظم عينات laly ثم اغلي الخليط لمدة خمس دقائق، وفصلها باستخدام هلام بولي أكريلاميد مسبق الصب بتركيز 12%. بعد غسل الهلام ثلاث مرات بالماء المقطر، يتم صبغها بصبغة Coomassie blue لمدة ساعة ثم إزالة الصبغة الزائدة طوال الليل في الماء بناءً على تركيزات حزم البروتين. قسّم كل ممر في الهلام إلى 12 جزءاً، ثم قطع كل جزء إلى قطع بحجم 1 mm وضعها في أنبوب سعة 1.5 mL.

اغمر قطع الهلام تماماً في محلول بيكربونات الأمونيوم بتركيز 0.1 molar في 50% aceto nitrile. بعد ذلك، غطِ القطع بـ 100% aceto nitrile لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة السائل وتجفيف القطع باستخدام جهاز speed vac.

بعد ذلك، أضف حجماً مساوياً من محلول tripsin وضعه على الثلج لإعادة الترطيب. ثم قم بالتحضين عند 37 degrees Celsius لمدة تتراوح من 12 إلى 16 ساعة لإتمام عملية هضم triptych. بعد ذلك، قم بإزالة مستخلص البروتين السائل من العينات التي تم تحضينها.

أوقف التفاعل وقم بإزالة أي هضم بروتيني متبقٍ عن طريق تغطية قطع الهلام بـ 5% formic acid و 50% aceto nitrile. بعد ذلك، قم برج قطع الهلام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انقل السائل الطافي إلى أنابيب عينات البروتين المستخلصة بعد إجراء عمليتي استخلاص إضافيتين.

جفف العينات باستخدام جهاز التجفيف بالتفريغ المركزي (speed vac) في أنابيب سعة 0.5 milliliter. قم بتحضير ملاط (slurry) بتركيز 50% من راتنج anti TMT في محلول TBS بتركيز يتناسب مع كثافة حزمة البروتين المعنية. اغسل الراتنج ثلاث مرات بحجم عمودي واحد من محلول TBS بتركيز 1x، ثم أضف 200 microliters من محلول TBS إلى كل عينة.

بعد ذلك، يتم النقل إلى راتنج anti TMT والرج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، يليه الهز طوال الليل في درجة حرارة 4 °C. يتم تحميل كل عينة على عمود، ثم تُجرى عمليات غسل للعمود بحجم 200 µL لكل غسلة.

بعد ذلك، يتم شطف كل عينة ثلاث مرات باستخدام 200 µL من محلول الاستخلاص بتركيز 50% والتجفيف تحت التفريغ. ثم تُعلق العينات في 12 µL من الأسيتونتريل بتركيز 3% مع 0.1% حمض الفورميك، ويُحقن 5 µL مباشرة في عمود HPLC. يتم استخلاص الببتيدات باستخدام تدرج متزايد من الأسيتونتريل كما هو مفصل في النص المصاحب.

استخدم مطيافية الكتلة للكشف عن الببتيدات في سير عمل "top two by three". ابدأ بمرحلة واحدة من ms، ثم احصل على ثلاثة أطياف Ms.Ms باستخدام تفتيت التفكك المحتجز في مصيدة كولومبية بطاقة أعلى، يتبعها ثلاثة.

تقنية Ms.MS مع التفكيك المستحث بالتصادم لتحديد البروتين. قم بتحليل بيانات طيف الكتلة باستخدام سير عمل متفرع. قم بتنفيذ مُكمّم حديد مُبلّغ لتقدير النسبة.

قم أيضاً بمعالجة طيف MSM MS من خلال عقد مختار الطيف ومطبع الطيف ومجمع الطيف، ثم استعلم عن البيانات مقابل محرك البحث seaquest. تظهر هذه الصورة أمثلة لورقة نبات طماطم ضابطة على اليسار وورقة محقونة بـ pseudomonas على اليمين بعد صبغ الأوراق باستخدام DAB. تسمح عملية صبغ DES للصبغة الهستوكيميائية بإظهار علامات أنواع الأكسجين التفاعلية في أنسجة الورقة.

كما هو متوقع، لا تظهر عينة الضبط أي تلوين ملحوظ، بينما تظهر الأوراق المعاملجة ببكتيريا pseudomonas تلويناً إيجابياً لإنتاج hydrogen peroxide. يوضح هذا المثال مخرجات بيانات استكشاف البروتوم، حيث تتيح مساحة ذروة البروتين المنظم بشكل تفاضلي وفقاً لحالة الأكسدة والاختزال لكل عينة إجراء قياس كمي مطلق. وتشير مساحة الذروة بين عينات الضبط والعينات الملقحة إلى الكميات النسبية.

هنا، يظهر التنظيم الاختزالي للبروتين بين العينة الضابطة والعينة الملقحة بشكل متشابه. وتشير القمم ذات الكثافة المماثلة إلى وجود روابط disulfide غير خاضعة للتنظيم بفعل التغيير في المعاملة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بشكل صحيح في غضون أسبوع واحد.

تذكر الحفاظ على برودة العينات وتنظيم الملصقات التوضيحية. كما يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند استخدام الفينول، مثل ارتداء القفازات والعمل داخل خزانة سحب الغازات باتباع هذا الإجراء. ويمكن إجراء تدابير أخرى، مثل تحليل قياس الطيف الكتلي المحدد للتعديلات ما بعد الترجمة، من أجل تحديد تعديلات نظامية أخرى مثل حمض الأونيك ومحاكاة الغلوتين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ تفعيل CTMD في وضع الاستعداد لـ DIB وتأهيل redox 16.