تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

مرحباً، أنا راجا تي، باحثة دكتوراه في معهد بيكر IDI للقلب والسكري. سأصحبكم خلال الخطوات المتبعة في التوضيح ثلاثي الأبعاد للتعديلات الشرقية التي ميزت تلف DNA وتكثف الكروماتين في خلية قلبية جديدة. يلتف DNA حول مناطق نووية.

يتكون كل نوكليوزوم من أربعة أنواع مختلفة من الهستونات، وهي H2A وH2B وH3 وH4. ويؤدي حدوث تكسرات في الحمض النووي DNA إلى ظهور علامة $\gamma$H2AX. وتحدث $\gamma$H2AX بشكل أساسي في الكروماتين الذي يتميز بمثيلة H3K4. سنقوم الآن باستعراض توضيح ثلاثي الأبعاد للتعديلات في خلية مناعية موسومة بـ $\gamma$H2AX وH3K4 الممثيلة.

لنبدأ الآن. نبدأ بوضع E من معلق الخلايا في أنابيب Falcon سعة 15 مل. يتم غسل S مرتين باستخدام PB عن طريق الترسيب عند 150 G ثم إعادة التعليق.

قم بالتعليق في وسط غذائي (Media) جديد لرؤية التأثير المباشر للإشعاع (Radiation) على الأحداث الخلوية. احتفظ بالخلايا فوق العيون لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق قبل وأثناء التعرض للإشعاع. عرض الخلايا إما لأشعة غاما أو الأشعة السينية. بعد الإشعاع، وزع 3 milliliters من معلق الخلايا في كل وحدة GU من أصل ست وحدات.

طبق الآبار لقياس ذروة gamma H2AX؛ يتم تحضين الخلايا لمدة تتراوح بين 30 دقيقة وساعة واحدة عند 37 °C. نستخدم جهاز Cytospin لوضع الخلايا غير الملتصقة على شرائح زجاجية. عند تجميع مشبك Cytospin، تأكد من تطابق كامل سلك المرشح مع القمع.

قم بتوزيع 50 µL من معلق الخلايا هذا على كل شريحة، ثم ضع مشابك السيتوسين في جهاز طرد مركزي سيتوسيني وقم بتدويرها بسرعة 500 RPM لمدة خمس دقائق. قم بإزالة مشابك السيتوسين وافصل الشرائح عن بطاقة الترشيح. لا تترك الخلايا تجف في الهواء لفترة طويلة لأن ذلك قد يؤثر على الخلفية في صبغ الفلورسين.

باستخدام دبابيس سد سائلة لرسم دوائر حول كل مسحة، نقوم بتثبيت الخلايا باستخدام 4% paraformaldehyde في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. وقد لوحظ أن التثبيت باستخدام 4% paraformaldehyde كان أفضل مقارنة بالإيثانول أو الزيت. تُنضج الشرائح باستخدام PPS لنفاذية الخلايا مع Triton X 100 في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

مقارنةً بـ twin 80، لاحظنا إشارة أفضل في الخلايا التي عولجت بـ Triton X 100. راقب الخلايا مع PP S3 ثلاث مرات، لمدة خمس دقائق في كل مرة. قم بحجب الخلايا باستخدام BSA بتركيز 1% لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وكرر هذه العملية ثلاث مرات مقارنةً بعوامل الحجب وأزمنة أخرى.

كان BSA الأكثر كفاءة في تقليل الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة الأولية، حيث استخدمنا جسمين مضادين أوليين بتركيز تخفيف 1:500 مع 1%BSA وبكمية تقريبية تبلغ 50 µL من الجسم المضاد الأولي لكل شريحة. ويؤدي تحضين الجسم المضاد الأولي في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة إلى تقليل صبغ الخلفية مقارنة بالتحضين طوال الليل عند 4 °C. تُغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق.

تم استخدام Alexa floor 4 88 كمضاد للفأر، وAlexa floor 5 46 كمضاد للأرنب. استُخدمت الأجسام المضادة الثانوية لصبغ علامات مختلفة في آن واحد. استخدم أجساماً مضادة تم إنتاجها في أنواع مختلفة.

أضف حوالي 50 µL من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل شريحة. قم بتحضين الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. يُوصى بتحضين الخلايا داخل غرفة رطبة لمنع جفاف الخلايا والجسم المضاد. اغسل الشرائح باستخدام PB S ثلاث مرات، لمدة خمس دقائق في كل مرة.

تمت إضافة 50 µL من تخفيف بنسبة 1:500 من topo three في PBS إلى كل شريحة. تُغسل الشرائح بـ PBS ثلاث مرات، ولمدة خمس دقائق في كل مرة. يتم إزالة الرطوبة الزائدة من الشرائح ثم يُضاف محلول Antifa.

يُنصح بعدم تجفيف الخلايا تمامًا قبل إضافة محلول Antifa. ضع غطاء الشريحة فوق الشريحة، مع مراعاة تجنب تكون أي فقاعات هوائية.

اترك الشرائح طوال الليل في غرفة رطبة ومظلمة. قم بختم الشريحة باستخدام طلاء الأظافر لمنع جفاف الخلايا. وتكشف الصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر بؤري (confocal Microscope) عن.

تم الحصول على دقة مكانية أفضل باستخدام ليزر الهيليوم في عملية الحصول على الصور. وقد فُضّلت عدسات شيئية غمر زيتية بقوة 63x على العدسات ذات التكبير الأعلى أو الأقل. كما أن استخدام عامل تكبير يتراوح بين ثلاثة أو أربعة سيؤدي إلى إنتاج صورة بدقة أفضل.

لإجراء حسابات FO من خلايا متعددة، يُفضل استخدام سرعة مسح تبلغ ثمانية، وحجم صورة يبلغ 1024 في 1024 بكسل للخلايا. وعند التصوير لقنوات متعددة، يُوصى باستخدام اكتساب مسح خطي متسلسل مقارنة بالمسح الإطاري. ولتجنب بهتان العينة، يتم ضبط كسب الكاشف وإزاحة المضخم لتقليل الضوضاء وتشبع الإشارة.

بما أن حجم Kama HX X four قد يكون أقل من 0.5 micrometers، فيوصى بالتقاط صور بدقة 0.5 micrometer على الأقل. وتتطلب الصور الخاصة بحجم الخطوة على طول محور النفاثة نمط سلسلة نفاثات باستخدام نمط "العلامة أولاً وفقدان العلامة". ولتوضيح العلاقة المكانية بين البروتينات المختلفة، يوصى باستخدام سرعة مسح تبلغ ستة مع حجم صورة يبلغ 2048 و 2 48 pixels باستخدام metamor first.

ثانياً، يمكن إجراء العد من الصور التي يتم الحصول عليها باستخدام مجاهر بؤرية مختلفة. افتح علامات صور gamma hgx إما مباشرة من قائمة الملفات أو باستخدام أرقام الفواتير. العلامات. انتقل إلى قائمة المعالجة واختر الحساب المكدس (Stack arithmatic).

اختر الإسقاط الأقصى (maximum projection) وحدد المستويات المراد تضمينها، ثم انقر موافق. الآن اختر top hat وحدد صورة Gamma H two X كصورة مصدرية، ثم قم بالتطبيق.

سيكون فلتر القبعة العلوية (Top hat filter) والصورة الناتجة عبارة عن صورة ثنائية ذات ضجيج أقل وتباين منخفض في كثافة البؤر. انتقل إلى "المناطق" (regions) واختر أداة رسم المناطق وارسم مناطق حول النوى. انتقل إلى قائمة "المعالجة" (process) واختر "صورة العتبة" (threshold image).

اختر حد الشمول وقم بتعيين قيم الحد الأدنى والأقصى. عادةً ما تكون قيم الحدود هي التي تؤثر على الأرقام الأربعة. قيمة الحد المثلى هي تلك التي تقلل من شمول الخلفية وتزيد من شمول الأجسام المستهدفة إلى أقصى حد.

يمكن تحقيق ذلك على أفضل وجه من خلال حساب عدد الجولات باستخدام قيم عتبة مختلفة، ثم مقارنة عدد الجولات بالعد بالعين المجردة. اختر صورة DPI، وانتقل إلى قائمة المناطق (regions)، ثم حدد خيار نقل المناطق (transfer regions).

الآن أصبحت صور الأجسام الغريبة والأنوية المقابلة جاهزة للعد. يتم نقل معظم المناطق النووية إلى Top hat. انتقل إلى قائمة Measure واختر Integrated Area Analysis أو IMA، ثم حدد Measure all regions وانقر على measure للحصول على عدد FTE.

يمكن الآن تصدير أعداد مكافئ الدوام الكامل (FTE) لكل منطقة إلى جدول بيانات باستخدام خيار بيانات السجل (Log data). افتح صور جهاز عرض jet التي تم إنشاؤها مسبقاً لكل قناة. انتقل إلى العرض (display) واختر محاذاة الألوان (color align).

اختر الصور المصدرية المقابلة لكل قناة لإنشاء صورة مدمجة لجميع القنوات الثلاث. يتم إجراء تحليل المسح الخطي لتوضيح التموضع المكاني للعلامات المختلفة في النواة. انتقل إلى شريط أدوات القياس واختر "تحليل المسح الخطي" ثم ارسم خطاً عبر الخلية.

سيؤدي ذلك إلى إنشاء رسم بياني يوضح شدة الفلورة لكل قناة على طول الخط، ويمثل المسافة بين العلامات المختلفة بالنسبة لبعضها البعض. ولإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد من مجموعة صور متراكمة (stack)، انتقل إلى قائمة stack واختر 3D reconstruction، ثم حدد نوع 3D reconstruction كـ maximum.

اختر خطة الدوران، ثم اختر مسافة معايرة النفث. عادةً ما يقوم المستخدم بتحديد الخيار ثم النقر على موافق لإنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. وبهذا ينتهي البروتوكول الخاص بالتلوين المناعي الفلوري وتحليل الصور.

باختصار، يعد المجهر البؤري المناعي الفلوري تقنيتين للتصوير ثلاثي الأبعاد لمؤشرات C المختلفة وبؤر gamma H2AX في نواة الخلية. شكراً للمتابعة.