الجزئي الميكانيكية توصيف أنسجة الرئة باستخدام القوة الذرية الميكروسكوب

يتمثل الهدف العام للتجربة التالية في توصيف البيئة الميكانيكية المحلية لنسيج الرئة البرنشيمي بمقياس مكاني ذي صلة بالخلايا المقيمة، وذلك عبر القياس المباشر للخصائص المرنة المحلية لأنسجة رئة حديثة الاستخراج باستخدام تقنية التثليم الدقيق بمجهر القوة الذرية. ويتحقق ذلك عن طريق قطع نسيج رئة الفأر المنفوخ بالأغار باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط لتحضير شرائح من النسيج البرنشيمي للرئة بطول وعرض 5 × 5 مليمتر، وبسمك 400 ميكرومتر. بعد ذلك، يتم إجراء صبغ مناعي لشرائح نسيج الرئة غير المثبتة وغير المنفذة، وذلك لتحديد المناطق ذات الأهمية لعملية التثليم الدقيق بمجهر القوة الذرية.

بعد ذلك، يتم إجراء عملية نقر دقيق باستخدام مجهر القوة الذرية (FM micro indentation) على شرائح نسيجية في محلول PBS في درجة حرارة الغرفة. وبغرض القياس المباشر للخصائص المرنة الموضعية لنسيج الرئة الطازج، تم الحصول على نتائج تُظهر اختلافات ملحوظة في نطاق وتوزيع صلابة الأنسجة في متني الرئة الطبيعي والمتليف، وتغيرات مكانية كبيرة في الصلابة، لا سيما ضمن عينة الرئة المتليفة.

بناءً على خرائط الصلابة المستخلصة من منحنيات الإزاحة القسرية التي تم الحصول عليها باستخدام تقنية الـ FM micro indentation. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالقياسات الحالية، مثل تمدد شرائح الأنسجة، في أنها توفر دقة مكانية غير مسبوقة، مما يمنح منظوراً فريداً حول التباين على المقياس المجهري في صلابة الأنسجة. ويمكن لهذا القياس أن يساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية، مثل كيفية تباين الصلابة مكانياً داخل النسيج، وما هو نطاق ومقياس التغيرات المكانية في الصلابة عند الإصابة بالمرض.

العمليات التي تؤدي إلى إعادة تشكيل الأنسجة. لتحضير شرائح من أنسجة الرئة، ابدأ بتثبيت بنية الرئة لتمكين عملية التقطيع عن طريق نفخ رئتي فأر معزولتين. قم بالنفخ عبر الرغامى باستخدام 50 milliliters per kilogram من وزن الجسم من مادة aros الدافئة بتركيز 2% ذات نقطة تجميد منخفضة والمحضرة في PBS، ثم اربط الرغامى وبرد الرئتين المنفوختين في حمام من PBS عند درجة حرارة 4 °C لمدة 60 دقيقة. ستتحول مادة aros إلى هلام وتتصلب في المسافات الهوائية لتثبيت بنية الرئة بلطف. خلال هذه الفترة، وباستخدام شفرة حلاقة أو مشرط، قم بتقطيع أنسجة رئة الفأر المثبتة بمادة aros إلى شرائح يبلغ طولها وعرضها حوالي 5 by 5 millimeters، وبسمك 400 micrometers.

بعد ذلك، تُغسل الشرائح في PBS عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لإزالة بقايا aros لاستبعاد المجاري التنفسية والأوعية الكبيرة. تُقطع الشرائح من المناطق تحت الجنبية البعيدة عن القصبات الرئيسية في حال الرغبة في تصوير المجاري التنفسية أو الأوعية الكبيرة، وتُقطع الشرائح من أنسجة الرئة الأكثر قرباً من القصبات الرئيسية لعزل المناطق المستهدفة لإجراء FM micro indentation. يتم فحص النسيج باستخدام مجهر تباين الطور أو عن طريق الصبغ المناعي ثم الفحص باستخدام المجهر الفلوري.

يرجى مراجعة الجزء المكتوب من هذا البروتوكول لمعرفة الإجراء. وقبل البدء مباشرة في توصيف FM، يتم تثبيت شرائح النسيج على شرائح تغطية مقاس 15 مليمتر مطلية بـ poly L lysine عن طريق رفع شريحة التغطية من أسفل النسيج العائم، مع التأكد من انتشار شريحة النسيج بشكل متساوٍ على سطح شريحة التغطية. وإذا لزم الأمر، يمكن وضع الشريحة بين شريحة تغطية ثانية نظيفة وغير مطلية وتسليط ضغط خفيف للمساعدة في تثبيت النسيج على شريحة التغطية المطلية بـ poly L lysine.

قم بمعايرة نظام A FM وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة مباشرةً قبل كل جولة من تجارب التثليم الدقيق. وللقيام بذلك، حدد معاملين حرجين: ثابت الزنبرك للمجس باستخدام طريقة التقلبات الحرارية في الهواء، وحساسية انحراف المجس، وهو معامل يُستخدم لتحجيم إشارة مخرج الثنائي الضوئي لتتوافق مع مسافة انحراف المجس الفعلية.

قم بمعايرة حساسية الانحراف من خلال الحصول على منحنى إزاحة قسري قياسي في محلول PBS على شريحة زجاجية نظيفة. ثم احسب ميل منحنى الإزاحة القسرية في قياس منحنى الإزاحة القسرية. يتم مد طرف A FM نحو سطح العينة وسحبه منه في موقع واحد مع مراقبة انحراف العارضة delta D كدالة في إزاحة الطرف delta Z. يوصى باستخدام عارضة مثلثية من نتريد السيليكون ذات طرف كروي من السيليكات بقطر خمسة ميكرومتر باستخدام مجسات FM بثابت نابض قدره 0.06 newton's per meter.

لقد قمنا بتوصيف المواد اللينة ميكانيكيًا بمعامل قص يتراوح من 100 إلى 50,000 باسكال. امسح السطح السفلي لشريحة غطاء العينة باستخدام ورق مناديل، ثم ثبتها على شريحة زجاجية قياسية باستخدام شحم مفرغ. قم بتركيب الشريحة الزجاجية على منصة عينة AFM وغطِّ النسيج بـ 500 microliters من محلول PBS في درجة حرارة الغرفة.

ثم ضع رأس مسح الـ FM فوق العينة. اضبط منصة عينة المجهر لضبط المجهر للعرض عبر العدسة العينية لمحاذاة طرف الـ FM في مركز مجال الرؤية. حرك منصة عينة الـ FM لاختيار المنطقة المراد دراستها في النسيج.

بعد ذلك، انتقل إلى العرض عبر كاميرا CCD لتسجيل صور تباين الطور و/أو صور الفلورسنت للأنسجة حسب الرغبة. حرك طرف A FM ببطء إلى الأسفل حتى يلامس العينة بدقة. يتطلب توصيف التثليم الدقيق باستخدام A FM للعينات الرخوة أعماق تثليم صغيرة لتجنب الانفعالات الموضعية الكبيرة، والتي تؤدي إلى إبطال نموذج هيرتز (hertz model) المستخدم لحساب معامل المرونة؛ ولتجنب الانفعالات الكبيرة، قم بإجراء التثليم في وضع التشغيل (trigger mode) عن طريق ضبط الحد الأقصى لانحراف الكابول (cantilever) على 500 nanometers.

سيعمل حد الانحراف هذا على تقييد قوة الغرز القصوى لتكون أقل من 30 nano newtons. ويجب اختيار سرعة الغرز بحيث تكون بطيئة بما يكفي لاستكشاف الخصائص المرنة بدلاً من الخصائص اللزجة المرنة للعينة الرخوة. اختر نطاق سرعة يتراوح من 2 إلى 20 micrometers per second لأنسجة الرئة لإجراء قياس واحد من منطقة الاهتمام.

حرك مسبار الـ AFM إلى الموقع المطلوب وقم بإجراء عملية غرز واحدة لجمع منحنى قياسي للإزاحة والقوة. سيتحرك المسبار في اتجاه Z فقط. ولإجراء مسح آلي لمنطقة الاهتمام، انتقل إلى وضع خريطة القوة (force map mode)، ثم حدد حجم المسح ونقاط أخذ العينات داخل المنطقة المحددة.

يتحرك رأس مجهر القوة الذرية (AFM) عبر سطح العينة بين حركات الغرز، ويجمع منحنيات إزاحة القوة الفردية عند كل نقطة ضمن شبكة عينة محددة. ووجدنا من الناحية العملية أن استخدام شبكة عينة بمقاس 16 في 16 لرسم خريطة لمنطقة بمساحة 80 ميكرومتر في 80 ميكرومتر وبسرعة غرز تبلغ 20 ميكرومتر في الثانية هو أمر فعال، حيث يمكن إتمام هذه العملية في غضون 10 دقائق تقريبًا. ولحساب معامل يونغ، يتم مطابقة منحنى الإزاحة والقوة مع نموذج هرتز للغرز الكروي باستخدام طريقة المربعات الصغرى لملاءمة المنحنيات غير الخطية كما هو موضح هنا، حيث تعادل F القيمة K sub C مضروبة في delta D، وهي القوة اللازمة لثني العارضة.

تمثل K sub C ثابت الزنبرك للرافعة، بينما يمثل R نصف قطر طرف الكرة، وdelta والتي تساوي delta Z ناقص delta D هي مقدار الانبعاج، وnew هي نسبة بواسون للعينات، والتي تساوي 0.4 لأنسجة الرئة. ولتقييم جودة المطابقة، يتم حساب قيمة SSR أو مجموع مربعات الفرق بين البيانات وقيم المطابقة أثناء عملية مطابقة المنحنى غير الخطي.

استبعد القياسات غير الموثوقة أو غير القابلة للتفسير عن طريق التخلص من البيانات المستمدة من المنحنيات الرديئة ذات قيم SSR الكبيرة. وإذا رغبت في ذلك، قم بتحويل معامل المرونة أو E إلى معامل القص G باستخدام العلاقة E تساوي ضعف مجموع (1 + ν) مضروباً في G. ولتصوير أنماط الصلابة المكانية التي تم جمعها في وضع خريطة القوة، قم برسم بيانات المعامل وخرائط الكنتور، على سبيل المثال، في شبكة 16 في 16 تغطي مساحة 80 µm في 80 µm.

لمعالجة كمية كبيرة من بيانات منحنى القوة، يمكن كتابة خوارزمية مخصصة لملاءمة منحنيات إزاحة القوة تلقائيًا، واستخراج المعاملات و/أو رسم خرائط كنتورية أو رسم بياني لـ ELA. وباستخدام نفس الإجراءات والمعلمات المذكورة للتو، يوضح هذا الشكل أن الأنسجة قد قُطعت وصُبغت بشكل صحيح. تظهر البنية المجهرية السنخية لنسيج الرئة محفوظة جيدًا، كما لوحظ من خلال التلوين المناعي الفلوري لمكون الغشاء القاعدي، laminin بدون تثبيت أو نفاذية.

تظهر هذه اللوحات صبغاً مناعياً فلورياً للكولاجين، إحداهما في رئتين طازجتين غير مثبتتين تم استئصالهما من فئران عولجت مسبقاً بـ PBS أو عولجت بـ bleomycin لتحفيز التليف. وتظهر هنا مخططات إزاحة القوة لعينات تم الحصول عليها بواسطة غرس مجهري بـ FM مع تطبيق القوة ذاتها. يولد رأس الـ FM انبعاجاً كبيراً في منطقة رخوة، مما يؤدي إلى منحنى إزاحة قوة مسطح نسبياً يظهر باللون الأزرق، مقابل انبعاج صغير ومنحنى إزاحة قوة حاد لمنطقة أكثر صلابة يظهر باللون الأحمر.

من أجل الحصول على منحنيات قوة نظيفة بعد كل عملية غرز، يجب سحب رأس مجهر القوة الذرية (AFM) تماماً من سطح العينة وبحيث يكون خالياً من التلامس قبل عملية الغرز التالية. تتوافق حالة الخلو من التلامس هذه مع المنطقة المسطحة من المنحنى حيث ينتقل الرأس دون حدوث انحراف في الرافعة. يوضح هذا الشكل منحنى قوة نموذجياً يفتقر إلى المنطقة المسطحة، وهو ما يحدث عندما لا يتم سحب الرأس بالكامل من سطح العينة، كما هو الحال عند التصاق العينة الرخوة بالرأس، مما يجعل من المستحيل تحديد نقطة التلامس إذا كان الرأس محاصراً تماماً داخل العينة الرخوة.

قد يبدو المنحنى بهذا الشكل دون انحراف واضح، ولكن مع ضوضاء طفيفة. يوضح هذا الشكل الصلابة. تم استخراج البيانات من منحنيات الإزاحة القسرية وعُرضت مكانياً على شكل خرائط صلابة يُشار إليها باسم ELAs graft حيث يتدرج اللون وفقاً للصلابة. وتُظهر خرائط ELAs graft اختلافات صارخة في مدى وتوزيع صلابة الأنسجة في متني الرئة الطبيعي والمتليف، بالإضافة إلى تغيرات مكانية كبيرة في الصلابة، لا سيما ضمن عينة الرئة المتليفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيف البيئة الميكانيكية المحلية لنسيج الرئة عن طريق القياس المباشر للخصائص المرنة المحلية لأنسجة الرئة الطازجة باستخدام مجهر القوة الذرية.