تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

يستخدم هذا البروتوكول التفاعل بين فيروس شلل الأطفال والأجسام النانوية التي تتعرف على فيروس شلل الأطفال لتوضيح مقايسة بسيطة لالتقاط الألفة في الطور السائل كمياً. بشكل أساسي، تُستخدم حبيبات مغناطيسية مطلية بالكوبالت لسحب البروتينات الملحقة بعلامة، بالإضافة إلى أي بروتينات متفاعلة مُعلمة إشعاعياً. أولاً، اخلط البروتينات المُعلمة والملحقة بعلامة ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، يتم إضافة حبيبات مغناطيسية تتعرف على الوسم، ثم تُفصل الحصة المرتبطة من البروتين المَوْسم عن الحصة غير المرتبطة باستخدام المغناطيس. بعد ذلك، يتم قياس إشارة البروتين المَوْسم الموجود في الحصة غير المرتبطة وتحديد كميته. وتعد نتائج مقايسة الألفة في الطور السائل هذه مفيدة للغاية عند تحليل البروتينات الحساسة للتحول التشكلي.

يمكن لمقايسة الالتقاط بالتقارب في الطور السائل هذه أن توفر رؤية واضحة حول التفاعل بين الأجسام النانوية المعترفة بفيروس شلل الأطفال ومستضدات مختلفة لفيروس شلل الأطفال. كما يمكن تطبيق هذه الطريقة على تفاعلات بروتين-بروتين أخرى بشرط إمكانية وسم أحد البروتينين والقدرة على الكشف عن البروتين الآخر. لقد حصلنا أولاً على الفكرة لهذه الطرق عندما كنا مهتمين باستقصاء التفاعل بين الأجسام النانوية المعترفة بفيروس شلل الأطفال ومستضدات مختلفة لفيروس شلل الأطفال.

بما أن فيروس شلل الأطفال حساس للتغيرات التشكيلية عند التصاقه بسطح صلب، فإن استخدام تقنية e LSA يكون محدوداً. ولذلك، يفضل استخدام نظام قائم على الطور السائل. ومن الأمثلة على هذه الأنظمة القائمة على الطور السائل والتي تُستخدم غالباً في أبحاث فيروس شلل الأطفال هي تقنية micro protein.

مقايسة الترسيب المناعي. وعلى الرغم من أن هذا الاختبار قد أثبت قابليته للتطبيق، إلا أنه يتطلب البنية البلورية لجسم مضاد تقليدي، وهي بنية غير متوفرة في الأجسام المضادة النانوية. هذه الأجسام المضادة النانوية، وهي أجسام مضادة أحادية النطاق مثيرة للاهتمام ومستقرة للغاية، يمكن هندستها بسهولة بنصوص مختلفة.

تُظهر هذه المجموعة المستخدمة على نطاق واسع ألفة تجاه الأيونات ثنائية التكافؤ، مثل النيكل والكوبالت، والتي يمكن بدورها تغليف الخرزات المغناطيسية بها بسهولة. وبناءً على ذلك، قمنا بتطوير مقايسة التقاط ألفة كمية بسيطة تعتمد على خرزات مغناطيسية مغلفة بالكوبالت.

قم بإعادة تعليق مخزون الخرزات المغناطيسية باستخدام جهاز الرج الدوامي (vortex)، ثم انقل 10 µL من كل عينة إلى أنبوبة، وقم بترسيب الخرزات باستخدام مغناطيس. أزل السائل الطافي الشفاف لغسل الخرزات. أضف 150 µL من محلول الربط المنظم (binding buffer).

قم بجمع الخرزات باستخدام مغناطيس وأزل السائل الطافي بعد غسلة ثانية. أعد تعليق الخرزات في 40 µL من محلول الربط المنظم لكل عينة ضابطة. وبالنسبة للخلفية في العينة الأولى، قم بتجهيز بئر بدون فيروس مُعلم إشعاعياً، ولكن بحجم مساوٍ من محلول الربط المنظم للضابطة.

خذ عينة من نشاط إشعاعي بنسبة 100%. أضف جميع المكونات إلى بئر واحدة باستثناء استبدال الجسم النانوي بمحلول ربط. الآن أضف 2000 عدة في الدقيقة من فيروس شلل الأطفال سلالة 7 النوع 1 المسمى بـ S 35 في حجم إجمالي قدره 80 µL من محلول الربط إلى جميع العينات.

قبول العينة الضابطة. العينة الأولى. أضف 10 µL من تخفيف الجسم النانوي إلى كل عينة.

اخلط جيداً لمدة 10 ثوانٍ على هزاز وبقِ العينة في الحضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 40 µL من معلق الخرزات المغناطيسية المغسولة وبقِ العينة في الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج المستمر، ثم قم بترسيب الخرزات باستخدام مغناطيس وانقل السائل الطافي المصفى إلى أنبوب لقياس النشاط الإشعاعي لكل عينة، وانقل 50 µL من السائل الطافي إلى دورق عد. أضف ثلاثة mL من خليط سائل الوميض وقم بالقراءة باستخدام جهاز عد الوميض.

قم بسحب الخرزات المغناطيسية المستخدمة في أنبوب باستخدام الماء، ثم قم بطردها مركزياً عند 500 ×g لمدة دقيقتين. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخرزات في 6 mL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.5 M. بعد ذلك، وزع المعلق على أنابيب متعددة وقم بحضنها في حمام موجات فوق صوتية لمدة خمس دقائق.

بعد تجميع الخرزات باستخدام مغناطيس وإزالة السائل الطافي، أضف 1 mL من محلول SDS بتركيز 2% إلى كل أنبوب، ثم اخلط المزيج باستخدام جهاز vortex ورقاقة القصدير لمدة خمس دقائق. الآن، قم باستعادة الخرزات. أضف 1 mL من EDTA بتركيز 0.2 M وبدرجة pH 7 إلى كل أنبوب، ثم حضّن الأنابيب في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق.

ثم اجمع الخرزات، واغسل الخرزات بـ 1 mL من الماء ثلاث مرات، يليه 1 mL من محلول كلوريد الكوبالت بتركيز 10 mM. ضع الأنابيب على جهاز رجاج لمدة 10 دقائق. انتقل إلى مرحلة حصاد الخرزات باستخدام مغناطيس ثم أعد تعليقها في 1 mL من محلول الارتباط المنظم.

اغسل مرتين في 1 mL من الـ Ethanol بتركيز 20%، ثم أعد تعليق الخرزات في حجمها الأصلي من الـ ethanol بتركيز 20% للحصول على خرزات مُجددة بتركيز 40 mg/mL. قم بتصحيح النشاط الإشعاعي للخلفية عن طريق تعيين عينة التحكم الأولى كقيمة 0% للنشاط الإشعاعي وعينة التحكم الثانية كقيمة 100% للنشاط الإشعاعي.

الآن، بالنسبة لكل عينة، احسب النسبة المئوية للنشاط الإشعاعي في السائل العلوي كمقياس للترسيب الكلي للفيروس المسمى إشعاعياً بواسطة الجسم النانوي. يقيّم هذا الاختبار ألفة PVSS 38 C والجسم المضاد الخاص بفيروس شلل الأطفال باستخدام ثلاثة مستضدات مختلفة لفيروس شلل الأطفال، وهي: المستضد الأصلي، والمستضد المسخن، والوحدات الفرعية 14 s. ومن المثير للاهتمام أن النشاط الإشعاعي في السائل العلوي للعينات التي تحتوي على الوحدات الفرعية 14 s المسمى إشعاعياً ينخفض مع زيادة تركيزات الجسم النانوي PVSS 38 C. يشير هذا إلى زيادة في كمية الوحدات الفرعية 14 s لفيروس شلل الأطفال المرتبطة بالجسم النانوي PVSS 38 C، وبشكل غير مباشر بالخرزات المغناطيسية.

نظرًا لعدم ملاحظة أي ألفة لـ pvs S 38 C تجاه الشكلين المستضديين N وH لفيروس شلل الأطفال، يبدو أن الجسم النانوي متخصص في الوحدة الفرعية 14 s لفيروس شلل الأطفال. وتعد ألفة الجسم النانوي تجاه مستضداته، كما تم قياسها بهذه الطريقة، محددة تمامًا مثل الجسم النانوي غير المرتبط. حيث لا يظهر NB one أي تفاعلية ضد الأشكال المستضدية الثلاثة لفيروس شلل الأطفال.

يُنتج هذا النظام درجة عالية من التكرارية كما هو موضح في منحنى الاستجابة للجرعة هذا، والذي تم إنشاؤه بواسطة باحثين مختلفين في أيام مختلفة. وبمجرد إتقان هذا الفحص الموثوق للالتقاط بالتقارب في الطور السائل، يمكن إجراؤه بشكل صحيح خلال ساعتين، بما في ذلك إعادة تدوير الخرزات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية استخدام فحص الالتقاط بالتقارب في الطور السائل القائم على الخرزات المغناطيسية عند دراسة التفاعل بين البروتينات المختلفة، خاصة عندما لا يمكن استخدام الأنظمة القائمة على الطور الصلب.