وبنقل العدوى إلى الإنسان Nucleofecting الجذعية المحفزة المستحثة خلايا

الهدف العام من هذه التجربة هو تحقيق كفاءة ترنسفكشن عالية في الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات باستخدام بروتوكولات محسنة للترنسفكشن والتأثير النووي. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إنشاء مزارع خالية من الخلايا المغذية للخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات. ولإجراء عملية الترنسفكشن، يتم وضع الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات على gelt أو TRX أو matrigel طوال الليل.

بينما بالنسبة للتحصيل النووي، يتم الحصول على تكتلات خلوية صغيرة باستخدام التريpsin، ثم يُضاف خليط من DNA البلازميد وكاشف ترانسفكشن gene juice إلى الخلايا المزرعة، وبعد ذلك يتم تدوير الطبق وحضنه عند 37 درجة مئوية. يتم إجراء التحصيل النووي لمعلق خلايا IPS البشرية في جهاز التحصيل النووي، ثم تُعاد تعليق الخلايا في وسط conditioned medium، وتُحضن عند 37 درجة مئوية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تلاعباً جينياً فعالاً من خلال كفاءة ترانسفكشن عالية في خلايا IPS البشرية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل طرق التثقيب الكهربائي للترانسفكشن (transfection electroporation) وطرق التأثير النووي (nuclear affection) الموصوفة سابقاً، في إمكانية تحقيق كفاءة ترانسفكشن عالية في خلايا IPS البشرية وبنتائج متسقة بشكل روتيني في مختبرنا. كما تضمن بروتوكولاتنا الحد الأدنى من موت الخلايا بعد التعديل الوراثي. وبناءً على ذلك، تسمح بروتوكولاتنا بتوليد سريع وواسع النطاق لخطوط خلايا IPS البشرية المعدلة وراثياً. قبل تكييف الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات مع المزارع الخالية من الخلايا المغذية، قم بتحضير أطباق مطلية بـ gelt TRX.

بعد ذلك، قم بتدليك الخلايا الجذعية السلفية للمؤقتات البشرية (human IPCs) التي تمت صيانتها سابقاً على خلايا مغذية بمقدار 1 mL من Accutane لكل بئر، وتحضينها عند 37 °C لمدة دقيقة واحدة وإلى أن تبدأ معظم الخلايا في الانفصال، ثم أضف من 10 إلى 15 خرزة زجاجية إلى الخلايا وقم بهز الطبق برفق. بعد ذلك، أضف 2 mL من knockout D-M-E-M-F 12 وقم بالتقليب بلطف. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 10 mL.

قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 800 RPM لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. اشفط السائل الطافي، مع ترك كتلة خلايا hIPSC سليمة. قم بنقر الأنبوب برفق لتفريق كتلة الخلايا بلطف.

يا ريس، قم بتعليق كريات الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (human IPSC) في حجم مناسب من وسط STEM pro ووزعها بين آبار طبق مطلي بـ TRE gel. بناءً على معدل التكاثر، يمكن تمرير الخلايا السلفية البشرية (human IPCs) بنسبة تقسيم تتراوح من 1:2 إلى 1:6. ضع الطبق بعناية في حاضنة تحتوي على 5% carbon dioxide ودرجة حرارة 37 degrees Celsius، وقم بتدوير الطبق برفق لضمان توزيع الخلايا بالتساوي عبر الآبار.

قم بتغذية الخلايا يومياً. عندما تصل الخلايا إلى 80% من درجة التلاقي، تصبح جاهزة للنقل مرة أخرى إلى هلام جديد. يجب أن تكون الخلايا في الآبار المطلية بـ Rex، وبنسبة تقسيم واحد إلى اثنين، في حالة تلاقٍ تتراوح تقريباً بين 40 إلى 50%، وتكون موزعة بالتساوي على شكل مستعمرات صغيرة في الآبار المطلية بالهلام في يوم عفن الخلايا (transfection) لتحقيق كفاءة عفن مثالية.

لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير 100 µL من وسط knockout في أنبوب eend orph معقم سعة 1.5 mL. أضف 27 µL من كاشف transfection gene juice، وامزجه جيداً ثم حضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 4 µg من الـ plasmid DNA.

يعد اختيار البلازميد أمراً حاسماً لتحقيق كفاءة ترنسفكشن مثالية. يحتوي البلازميد المستخدم هنا على بروتين فلوروسنت أخضر مُحسّن يعمل تحت تحكم محفز CAG، وهو محفز قوي نشط نسخياً في الخلايا السليفة المكونة للبنكرياس (IPCs) البشرية. قم بحضن الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد مرور 15 دقيقة، أضف مزيج الحمض النووي (gene juice, DNA mixture) إلى الخلايا وقم بتغطية الطبق. قم بتدوير الطبق بسرعة 1,200 RPM لمدة خمس دقائق لزيادة تلامس مزيج عفن الخلايا (transfection mixture) مع الخلايا السلفية القلبية البشرية (human IPCs) الموجودة في الفجوة. حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 °C طوال الليل وحتى اليوم التالي.

راقب كفاءة عفن التحويل في يوم التأثير النووي، وقم بمعالجة الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (IPCs) مسبقاً باستخدام 10 micromolar من مثبط rock لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 °C أثناء المعالجة المسبقة لهذه الخلايا. قم بتحضير 82 µL من محلول المؤثر النووي للخلايا الجذعية البشرية في أنبوب إبندورف معقم سعة 1.5 mL. أضف 80 µL.

أضف المكمل الأول واخلطه جيداً عن طريق السحب بالماصة. حضن المحلول عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتدفئة الوسط الغذائي المكيف من الخلايا المغذية (feeder cell conditioned media) الذي تم تحضيره مسبقاً و0.25% trypsin-EDTA إلى 37 درجة مئوية تحت غطاء التدفق الصفائحي.

قم مسبقاً بتسمية أنبوب مخروطي معقم سعة 15 milliliter واحد. أزل الوسط الغذائي بعناية من مزرعة خلايا IPSC البشرية المراد إجراء التأثير النووي عليها، واغسل الخلايا برفق باستخدام phosphate buffered saline. اسحب PBS ثم أضف trypsin واحضن الخلايا عند 37 °C لمدة ثلاث دقائق.

لضمان نجاح التأثير النووي، من الضروري عدم استخدام التريبسين لتحويل الخلايا إلى خلايا مفردة. وبدلاً من ذلك، يجب سحق الخلايا إلى تكتلات صغيرة تتكون من خليتين إلى ثلاث خلايا. قم بإعادة تعليق الخلايا برفق باستخدام طرف ماصة P 1000 إلى تكتلات صغيرة تتكون من خليتين إلى ثلاث خلايا.

اغسل قاع البئر عن طريق السحب والتفريغ المتكرر باستخدام الماصة للتأكد من انفصال جميع الخلايا السلفية القلبية البشرية (human IPCs) تماماً. ثم انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter مُسمى. بعد ذلك، أضف تسعة milliliters من وسط زراعة الخلايا الليفية الجنينية للفئران.

لتعطيل مادة الـ tripsin، قم بتدوير الخلايا بسرعة 800 RPM لمدة ثلاث دقائق. اسحب السائل الطافي (SUP natant) بعناية مع ترك كتلة الخلايا المترسبة (cell pellet) كما هي. علّق الخلايا في 100 µL من محلول فعال للنواة للخلايا الجذعية البشرية المجهّز مسبقاً.

باستخدام طرف ماصة سعة 1 mL، انقل الخلايا إلى أنبوب تأثير نووي. أضف 4 µg من DNA البلازميدي إلى معلق الخلايا في الأنبوب، ثم اخلط الخلايا و DNA عن طريق التدوير اللطيف. انقر على الأنبوب مرتين على سطح غطاء التدفق الصفائحي.

أدخل الأنبوب في حامل المؤثر النووي الخاص بجهاز التأثير النووي. اختر البرنامج B 0 1 6 لخلايا التأثير النووي بالضغط على الزر x، وسوف تظهر كلمة Okay عند اكتمال عملية التأثير النووي، والتي تستغرق عادةً من ثانية واحدة إلى خمس ثوانٍ. استخدم ماصة الباستير البلاستيكية المتوفرة في طقم التأثير النووي لاستعادة الخلايا المتأثرة نووياً؛ واستعد الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في وسط CM مـُدفأ مسبقاً ومثبط الصخور في أنبوب إبندورف معقم سعة 1.5 milliliter، ثم حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 °C لمدة 10 دقائق.

بعد مرور 10 دقائق، استخدم رأس ماصة سعة 1 مل لنقل الخلايا قطرة تلو الأخرى فوق طبقات الخلايا المغذية. قم بتحضين الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل وحتى اليوم التالي. راقب كفاءة عفن الخلايا (transfection efficiency).

تظهر هنا صور مجهرية لخلايا RIV one البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) التي تعبر عن EGFP، والتي تم ترانسفكشنها باستخدام gene juice on gel Rex بعد 12 ساعة من ترانسفكشن البلازميد. ترانسفكشن الحمض النووي DNA للخلايا البشرية iPSCs. عادةً ما يؤدي استخدام gene juice مع محفز قوي إلى الحصول على أكثر من 60% من الخلايا التي تعبر عن المراسل EGFP في اختبار ترانسفكشن عابر.

يمكن أيضًا الحصول على خلايا تعبر عن EGFP عن طريق النقل النووي كما هو موضح في هذه الصور لـ RIV one human IPCs التي تم زرعها وتشكيلها على خلايا مغذية بعد النقل النووي باستخدام إما برنامج النقل النووي B 0 1 6 أو برنامج النقل النووي A 0 2 3. يؤدي استخدام برنامج B 0 1 6 إلى الحصول على ما يصل إلى 80% من الخلايا الموجبة لـ EGFP، بينما أنتج برنامج A 0 2 3 أقل من 10% من الخلايا الموجبة لـ EEG FP. علاوة على ذلك، يمكن اشتقاق مستنسخات مستقرة من human I PSCs المعدلة وراثياً والتي تعبر عن جين trends.

يظهر هنا مثال لمستعمرات من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) التي تعبر عن بروتين EGFP بشكل مستقر، مع تعبير منتشر لبروتين EGFP مشتق من gene juice. تحتفظ هذه الخلايا بالتعبير التأسيسي لبروتين EGFP أثناء تمايز الجسم الجنيني. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء عملية النقل النووي والترانسفكشن للخلايا الجذعية البشرية المستحثة (iPS cells).

تعد التلاعبات الجينية الفعالة أداة أساسية لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلايا الجذعية، ومن شأنها أن تسرع من استخدام خطوط خلايا IPS البشرية في الطب التجديدي.