إعداد Synaptoneurosomes من اللحاء باستخدام الماوس متقطع التدرج الكثافة Percoll - السكروز

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير مناطق مشبكية عصبية (synap to neuro zones) نشطة ترجمياً من قشرة دماغ الفأر، باستخدام تدرج كثافة سكروز غير مستمر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع وتجانس قشور الدماغ للفأر، ثم إجراء عملية طرد مركزي للمتجانس. بعد ذلك، يتم وضع ناتج الطرد المركزي المتجانس، أو السائل الطافي، على تدرجات السكروز المعدة مسبقاً.

تتمثل الخطوة النهائية في إجراء عملية الطرد المركزي وجمع كسر السينابتوسومات (synaptosome fraction). وفي النهاية، يُظهر تحليل لطخة ويسترن (western blot) وتجارب دمج الميثيونين S 35 أن كسر السينابتوسومات غني بالوصلات العصبية ونشط ترجمياً. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الموجودة مثل الطرد المركزي والترشيح في أن استخدام تدرجات الكثافة يمنع حدوث الضرر الميكانيكي أولاً، وثانياً، يتسم Percoll بسمية منخفضة تجاه الخلايا ومكوناتها.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة في هذا البروتوكول لأن التوقيت يلعب دوراً رئيسياً. فبمجرد حصاد القشور، يجب إكمال الإجراء بسرعة. لبدء الإجراء، قم بتحضير طبقات التدرج بنسب 3 و10 و15 و23% عن طريق إضافة الكميات المحددة من SIP إلى منظم GM كما هو موضح في المخطوطة المرفقة مع خلطها جيداً.

صب طبقات التدرج عن طريق سحب ملي لترين من كل من محاليل perol متساوية التوتر بتركيز 15% و10% و3% باستخدام الماصة في أنابيب طرد مركزي Beckman ذات أغطية. باستخدام ماصة P 1000، يجب أن يكون الحد الفاصل بين الطبقات واضحاً تماماً دون حدوث خلط بينها. تُحفظ التدرجات عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.

قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتحضير المحاليل الضرورية الأخرى كما هو موضح في المخطوطة المرفقة. يتم القتل الرحيم للفأر في العمر ما بين P 13 و P 21، ثم يتم تحضيره للتشريح عن طريق رش الجزء الخلفي من الرقبة والرأس بـ 70%ethanol. بعد ذلك، استخدم مقصًا حادًا للقطع عبر الحبل الشوكي عند قاعدة الجمجمة.

بعد ذلك، قم بإزالة الجلد من أعلى الجمجمة. اقطع الجمجمة جانبياً بين العظم الجداري والعظم بين الجداري، أو بين منطقتي المخ والقشرة المخية. بعد ذلك، اقطع الجمجمة من القاعدة وصولاً إلى الأنف على طول الدرز السهمي.

في هذه الخطوة، قم بإزالة العظم الجداري الرخو بعناية عن طريق سحب كل نصف كرة إلى الجانب. بعد ذلك، أدخل الملعقة المسطحة (spatula) في الدماغ فوق المخيخ لكشط القشرة الدماغية. ضعها في محلول GM المنظم المبرد بالثلج، وكرر الإجراءات مرة أخرى لجمع المزيد من القشور الدماغية.

الآن اشطف القشور في محلول GM المنظم المبرد بالثلج. بعد ذلك، انقل قشرتين إلى جهاز تجانس زجاجي يحتوي على 5 mL من محلول GM المنظم البارد. قم بتجانس القشور بلطف من خلال 5 إلى 10 ضربات باستخدام المهرس A (المهرس السائب)، متبوعة بـ 5 إلى 10 ضربات باستخدام المهرس B (المهرس الضيق).

يختلف عدد الضربات اعتماداً على جهاز التجانس المستخدم. انقل المادة المتجانسة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. قم بطردها مركزياً عند 1000 times.

يُوضع المزيج تحت تأثير الجاذبية لمدة 10 minutes عند درجة حرارة 4 °C في جهاز طرد مركزي Allegra six KR لترسيب الحطام الخلوي والنوى. تُوضع طبقة مقدارها 2 mL من السائل الطافي فوق كل تدرج بير أو سكروز (per or sucrose gradient)، بحيث يتم تخصيص تدرج واحد لكل قشرة دماغية كاملة، ثم تُغلق الأنابيب بإحكام. بعد ذلك، تُطرد الأنابيب مركزياً في دوار ثابت الزاوية بسرعة 32,500 ×g لمدة 5 minutes عند درجة حرارة 4 °C في جهاز طرد مركزي Beckman J 2 21.

عند اكتمال العملية، وباستخدام المحولات المناسبة، يجب أن يُظهر التدرج حزمة قوية من الـ SN؛ لذا قم بسحب المحلول الموجود فوق حزمة الـ SN والتخلص منه. باستخدام ماصة باستجلاسية، اسحب حزمة الـ SN عند الواجهة بين 15% و 23%، حيث يعطي التدرج الواحد عادةً ما بين 0.9 إلى 1.1 milliliters من الـ sns. بعد ذلك، انقلها إلى أنبوب مخروطي واحفظها على الثلج.

بعد ذلك، اضبط تركيز الملح في SNS عن طريق إضافة عُشر الحجم من محلول تحفيز منظم بتركيز 10 أضعاف. يمكن اختيارياً إضافة كلوريد الكالسيوم بتركيز 1000 ضعف للوصول إلى تركيز نهائي قدره 12 nano molar. بعد ذلك، أضف مخزون TTX بتركيز one millimolar للوصول إلى تركيز نهائي قدره one micromolar لتثبيط الاستثارة غير النوعية.

تتمثل الخطوة التالية في استخدام المستخلص فوق السوبرناتانتي (SNS) في التطبيق اللاحق المناسب، مثل دراسات ترجمة البروتين. وبالنسبة للتطبيقات الأخرى، يمكن تنقية مستخلص السوبرناتانتي أو تركيزه باستخدام طقم Pierce SDS page sample prep kit. ويمكن تحديد تركيز البروتين في SNS باستخدام طقم micro BCA protein assay kit.

فيما يلي مثال لست حزم أو أجزاء. عندما تم تجانس قشرة الدماغ للفأر وفصلها باستخدام تدرجات السكروز غير المتصلة، وجدت الحويصلات التشابكية الصغيرة (SNS) المثرية في الحزمة الخامسة عند الواجهة بين 23 و15%، وقد تمت إزالة هذه الحزمة وفحصها باستخدام المجهر الإلكتروني. ويظهر هنا في تحليل "وسترن بلوت" مثال للحويصلات التشابكية السليمة مع الحفاظ على العناصر قبل التشابكية وبعد التشابكية.

يظهر زيادة في الواسمات التشابكية وانخفاض في الشوائب في نطاق SN من تدرج السكروز غير المستمر للتأكيد على أن الزيادة في دمج S 35 methionine عند إضافة الغلوتامات تعود إلى تخليق البروتين من جديد. تم إضافة 40 micromolar من anesa mycin وهو مثبط لتخليق البروتين. يوضح هذا الشكل الانخفاض الملحوظ في دمج S 35 methionine في وجود anso mycin مع أو بدون وجود الغلوتامات مقارنة بالمستويات الأساسية.

وبذلك، تُنتج تدرجات السكروز غير المتصلة من نوع peral بسرعة جسيمات تحت خلوية (SNS) عالية النشاط ونقية نسبياً، والتي يمكن استخدامها لدراسة ترجمة البروتين. يوضح هذا الشكل أن النطاق الخامس من تدرج السكروز غير المتصل من نوع per core يحتوي على أعلى مستويات تخليق البروتين الجديد (de novo). وبالمقارنة، فإن جسيمات SNS التي تم تحضيرها عن طريق تمرير القشرة المتجانسة عبر سلسلة من المرشحات ذات أحجام مسام متناقصة ثم إجراء عملية الطرد المركزي فوق تدرج السكروز غير المتصل من نوع per core تحتوي على المزيد من الأغشية المكسورة وكمية أقل من جسيمات SNS السليمة مقارنة بتلك التي تم تحضيرها بطريقة تدرج السكروز غير المتصل من نوع peral. كما تظهر جسيمات SNS المحضرة باستخدام طريقة تدرج السكروز غير المتصل من نوع peral أنها تحتوي على نشاط تخليق بروتيني جديد (de novo) أكثر من جسيمات SNS المحضرة باستخدام طريقة الترشيح.

تُظهر النتائج أن عينات SNS المُحضرة من الفئران الأصغر سناً تمتلك نشاطاً ترجمياً أكبر مقارنة بالفئران الأكبر سناً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك تصور جيد حول كيفية عزل المناطق العصبية التشابكية النشطة ترجمياً عن طريق تجنيس قشور الدماغ لدى الفئران، ثم طرد المستحلب مركزياً باستخدام دوار ذو دلاء متأرجحة، ومن ثم طرد السائل الطافي مركزياً عبر تدرج السكروز العمودي في دوار ثابت الزاوية، وأخيراً جمع حزمة المناطق العصبية التشابكية الناتجة.