[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس

الهدف من هذا الإجراء هو تحديد منظمات التعبير البروتيني والتموضع البروتيني في مرحلة ما بعد الجنين في ديدان *C. elegans* باستخدام مسح جينومي يعتمد على تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) وبروتينات موسومة بفلورسنت. وبمجرد إنشاء سلالة المسح المناسبة، يتم اختيار مكتبة RNAi. وتتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في تعبئة مستنسخات المكتبة داخل البكتيريا.

يتم بعد ذلك اختيار البكتيريا وتنميتها ثم تغذية ديدان *C. elegans* في مراحل نمو محددة بها. وبعد ترك الديدان تنمو لمدة 72 ساعة، يتم فحصها لرصد أي تغيرات في النمط الظاهري المستهدف. وفي النهاية، يتم تصور التغيرات في تعبير البروتين المستهدف أو توضعه داخل الخلية باستخدام المجهر الفلوري.

يمكن لهذه الطريقة تحديد الجينات المطلوبة للتمركز الخلوي الصحيح لبروتين مُوسوم بفلورسنت. ومع ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول لتحديد الجينات التي تؤثر على أنماط ظاهرة أخرى ما بعد جنينية ذات أهمية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالبروتوكولات المنشورة الحالية في أننا قمنا بتحسين اتساق ومستوى استجابة RNAi في الحيوانات عن طريق تحفيز إنتاج الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة في البكتيريا قبل الزرع.

ستقوم كاثي فوس، الباحثة المساعدة في مختبري، بتوضيح الإجراء. في غضون شهرين من بدء التجربة، قم بإعداد مكتبة المستنسخات؛ أولاً عن طريق تخطيط البكتيريا من مستنسخات مكتبة التغذية المختارة، بالإضافة إلى ضوابط إيجابية وسلبية على أطباق LB تحتوي على tetracycline. بالنسبة للضابط الإيجابي، استخدم مستنسخاً يحتوي على جين ينتج نمطاً ظاهرياً ما بعد جنيني يعتمد على الجرعة، مثل BLE four. وبالنسبة للضابط السلبي، استخدم ناقلاً فارغاً أو مستنسخاً يحتوي على جين كاذب متوقع دون وجود أنماط ظاهرية ملحوظة.

قم بتحضين الأطباق طوال الليل، ولكل مستنبت قم بتلقيح 2 mL من وسط LB الذي يحتوي على 50 µg/mL من حمض الكربونيك باستخدام مستعمرة واحدة من أطباق التخطيط، ثم حضّن المستنبتات طوال الليل مع الرج. في صباح اليوم التالي، يجب أن تكون المحاليل عكرة؛ قم بتحفيز إنتاج الـ RNA مزدوج السلسلة عن طريق إضافة IPTG إلى المستنبتات وتحضينها لمدة 4 إلى 5 ساعات إضافية تحت نفس الظروف.

يضمن إضافة IPTG تثبيطاً مستحثاً لمنتج الجين بواسطة RNAi بشكل أكثر اتساقاً وقوة مقارنةً بالاعتماد فقط على IPTG ومحفور لوحة NGM. بعد فترة حضانة IPTG، يتم وضع 30 µL من مستنبت كل استنساخ في كل بئر من آبار لوحات NGM RNAi المجهزة المكونة من 24 بئراً. استنساخ واحد لكل بئر، مع تخصيص بئرين في كل لوحة لعناصر التحكم.

حدد موقع كل مكتبة بدقة. قم بإجراء الاستنساخ في أطباق ذات 24 بئراً، ثم ضع الأطباق بدون أغطيتها في غطاء تدفق معقم لتجف لمدة 20 دقيقة تقريباً. لا تسمح لحواف الآجار بالانفصال عن الطبق.

بمجرد تجفيف الديدورات الخيطية المصنفة على الأطباق، يتم تقديم التعليمات الخاصة بتحضير الديدورات الخيطية. في القسم التالي، ابدأ بمجتمع مصنف من اليرقات في المرحلة اليرقية الأولى أو L one. إن البدء بـيرقات L one يتجاوز الأنماط الظاهرية المميتة المحتملة في المرحلة الجنينية.

إن وجود مجموعة حيوانات في مراحل نمو متتابعة للفحص يزيد أيضاً من الثقة بأن أي تغيرات ملحوظة تعود إلى RNAi وليست مجرد تغيرات طبيعية تحدث في مراحل مختلفة. ومع ذلك، إذا تسبب RNAi في تأخر نمائي، فيجب على القائم بالفحص تدوين ذلك. تبييض مجموعة مختلطة المراحل من سلالة الفحص.

ستنجو فقط الأجنة المحمية بقشرة البيض في هذه الخطوة؛ حيث تصل الحيوانات إلى هذه المراحل في غضون 12 ساعة إذا أجريت العملية عند 20 degrees Celsius، أو في غضون 18 ساعة إذا أجريت عند 16 degrees Celsius في اليوم الذي يتم فيه تلقيح المزارع البكتيرية. اختر ثلاثة أطباق بقطر 100 millimeter من سلالة الفحص تحتوي على حيوانات سليمة وتضم كلاً من البالغين الحوامل والأجنة.

اغسل جميع الحيوانات في وسط M nine معقم وانقل سائل الغسيل إلى أنبوب معقم سعة 15 ملليلتر ذو غطاء لولبي. إذا كانت كمية سائل الغسيل أكبر من 3.5 ملليلتر، قم بطرد مركزي للحيوانات وأزل كافة السوائل باستثناء 3.5 ملليلتر. أما إذا كانت الكمية أقل من 3.5 ملليلتر.

زد الحجم إلى 3.5 milliliters باستخدام الماء أو M nine لتحرير الأجنة من البالغين، مع إضافة 1.5 milliliters من خليط هيدروكسيد الصوديوم والمبيض إلى كل عملية غسل. اترك الحيوانات تحضن لمدة لا تزيد عن 10 دقائق في هذا المحلول. بعد بدء المؤقت، قم برج كل أنبوب بواسطة جهاز الـ vortex لمدة 10 ثوانٍ، وكرر عملية الرج كل دقيقتين.

بعد كل عملية رجّ دوامي، افحص المحلول تحت مجهر تشريحي للبحث عن جثث الحيوانات. وفي غضون ست إلى ثماني دقائق، ستتجزأ البالغات ويتحرر الأجنة. قم بإزالة الأجنة من محلول المبيّض عن طريق تجميعها في كروية (pellet)، وإزالة أكبر قدر ممكن من السائل الطافي دون تحريك هذه الكروية.

بعد ذلك، أعد تعليق الراسب في حجم قدره 10 milliliters عن طريق إضافة M nine معقمة واستخدام التحريك. كرر عملية الغسل هذه مرة واحدة على الأقل حتى تختفي رائحة المبيض تماماً. لتحديد مرحلة الحيوانات بدقة أكبر، اجعلها تتوقف في مرحلة L1 عن طريق تفقيس الأجنة في وسط M nine بدون غذاء.

يتم ذلك عن طريق نقل الأجنة في وسط M nine إلى دورق إرلنماير صغير. يُرجّ الدورق طوال الليل في درجة الحرارة المناسبة للسلالة والتجربة. خلال هذا الوقت، ستفقس جميع الحيوانات وتتوقف في مرحلة السكون L one في اليوم التالي.

استأنف نمو اليرقات من نقطة زمنية محددة عن طريق نقلها إلى البكتيريا المُحضرة التي تعبر عن RNA مزدوج السلسلة. يتم ذلك في نفس اليوم الذي تم فيه وضع نقاط البكتيريا في أطباق ذات 24 بئراً. ابدأ بنقل حيوانات L1 إلى أنبوب سعة 15 milliliter ثم قم بطردها مركزياً. بعد ذلك، قم بتركيز الحيوانات في 0.5 إلى 1 milliliter من M9، وضع 5 µL من النيماتودا المركزة على طبق.

قم بعدد الحيوانات الموجودة في الطبق وضبط تركيز محلول النيماتودا. استهدف وجود 30 دودة لكل 3 إلى 10 µL. وأخيراً، ضع حوالي 30 من الحيوانات في المرحلة الأولى فوق البكتيريا في كل بئر من الآبار المُجهزة.

قد يؤدي وضع أكثر من 30 حيواناً في كل بئر من أطباق الـ 24 بئراً إلى حدوث مجاعة. بعد جفاف البقع، وهو ما سيستغرق بضع دقائق، يتم تثبيت الغطاء باستخدام الرباط المطاطي، ثم تُحضن الحيوانات في وضع مقلوب عند درجة الحرارة والمدة المطلوبة للوصول بالحيوانات إلى المرحلة المحددة. وبمجرد أن تصبح النيماتودا جاهزة للفحص، يتم التأكد من أن الضوابط الموجبة والسالبة تعطي الأنماط الظاهرية المتوقعة، ثم تُفحص الحيوانات التجريبية للكشف عن أي تشوهات نمائية.

بعد ذلك، وباستخدام مجهر تشريحي، يتم تثبيت من ثمانية إلى 12 حيواناً من كل بئر على شرائح Agri PET بتركيز 4% باستخدام قطرة حجمها 5 µL من المادة المخدرة. وبعد وضع غطاء الشريحة المناسب، يتم إجراء ملاحظات على خمسة حيوانات على الأقل باستخدام المجهر المركب. مع الاحتفاظ بقاعدة بيانات منظمة تشمل الجين، وعدد الحيوانات التي تمت ملاحظتها، والنتائج المظهرية.

بالنسبة لكل تجربة RNAi، تحقق من أي نمط ظاهري ناتج عن RNAi عن طريق نمط ظاهري ثانوي آخر إن أمكن، ومن خلال تكرار التجربة؛ ويمكن في التجارب المكررة استخدام بكتيريا من نفس الخط المخطط (streak). قد تؤدي الخطوط المخططة القديمة إلى نمو ضعيف في المزارع السائلة الليلية، لذا يجب إعادة تخطيطها أولاً. بعض المزارع البكتيرية لن تنمو بشكل جيد بسبب ناتج الجين المعبر عنه في البلازميد الخاص بها.

في هذه الحالة، قم ببساطة بتركيز البكتيريا قبل الزرع. وبالنسبة للفحص المستمر، من المهم توفير عدد كافٍ من الأجنة الجاهزة دائمًا لتحديد المرحلة العمرية. يجب أن تكون سلالة الفحص مغذاة دائمًا، وليست جائعة، وخالية من الملوثات التي قد تؤثر على النمط الظاهري المستهدف.

لقد وضعنا جدول صيانة لتغذية الحيوانات. تم تحديد الجينات التي تؤثر على تموضع DBL one بواسطة RNAi باستخدام سلالة مصممة لهذا الفحص. يشمل التعبير الطبيعي لوسم GFP dbl one أجسام خلايا الحبل العصبي البطني، وصفاً من النقاط في الحيوانات التي تم تغذيتها بـ RA مضاد للمعنى لـ DBL.

أظهر أحد جزيئات mRNA ضعفاً شديداً في تعبير DBL one. وكانت هذه الحيوانات صغيرة الحجم أيضاً، على غرار الحيوانات التي تفتقر إلى DBL L one الوظيفي. وقد نجح مسح RNA I في تحديد العديد من الجينات الأخرى التي تؤثر نواتجها على تموضع DBL one، مما أدى إلى توسيع فهمنا لكيفية انتقال TGF beta داخل الخلايا، ووفر نقطة انطلاق للعديد من الدراسات الإضافية.

باستخدام هذه الطريقة، يمكن لشخص واحد تجهيز ومراقبة مجموعتين إلى أربع مجموعات من التجارب أسبوعياً بشكل معقول. على سبيل المثال، يمكن مراقبة الحيوانات التي تم تجهيزها يومي الاثنين والثلاثاء يومي الخميس والجمعة على التوالي، كما يمكن تجهيز الحيوانات مرة أخرى يومي الجمعة والسبت لمراقبتهما يومي الاثنين والثلاثاء. المراقبة أثناء اتباع هذا الإجراء طوال فترة الفرز.

من المهم توفير عدد كافٍ من الأجنة الجاهزة للتحديد المرحلي، لذا يجب الحفاظ على سلالة الفحص بشكل منتظم. كما أنه من المهم تدوين ملاحظات تفصيلية حول جميع المشاهدات.