الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف مركبات جديدة تعدل نشاط قنوات البوتاسيوم المقومة للداخل. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة خلايا HK 2 9 3 المحفزة بالتيتراسايكلين، والتي تعبر عن قناة KIR ذات صلة، في طبق يحتوي على 384 بئراً. وتتمثل الخطوة الثانية في تحميل الخلايا بصبغة تقرير ثاليوم فلورية تسمى flu in two.

بعد ذلك، يتم غسل الصبغة غير المدمجة من الخلايا واستبدالها بمحلول منظم للمقايسة يحتوي على ضابط المركب الناقل أو المركبات المختبرة. وتتمثل الخطوة النهائية في إضافة محلول منظم محفز إلى الآبار لبدء تدفق الثاليوم. وفي النهاية، يُستخدم قارئ صفائح الفلورة لتحديد المركبات التي تغير حركة أيونات الثاليوم عبر قناة KIR.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالتقنيات الموجودة، مثل تقنية تثبيت الرقعة الكهربائية اليدوية (manual patch clamp electrophysiology)، في أنها تمكن الباحث من إجراء مئات التجارب في آن واحد وآلاف التجارب يومياً. تتيح هذه الطريقة للباحث فحص مكتبات تضم آلاف الجزيئات الصغيرة لاكتشاف مُعدِّلات قنوات البوتاسيوم ذات التقويم الداخلي. قبل يوم واحد من تجربة تدفق الثاليوم، قم بتفكيك الخلايا وتقدير كثافة معلق الخلايا كما هو موضح في المخطوطة المرفقة. بعد ذلك، استخدم وسط BH الذي يحتوي على 10% dialyzed FBS لزراعة 20,000 خلية أحادية النسيلة محولة جينياً بشكل مستقر بجين قناة KIR المطلوب في كل بئر من آبار طبق BD pure coat Amin المكون من 384 بئراً، وذلك باستخدام thermo multi drop combi أو ماصة متعددة القنوات. وفي اليوم التالي، افحص الطبق تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا ملتصقة وموزعة بالتساوي عبر قاع الآبار.

بعد ذلك، استخدم غسالة الأطباق الدقيقة ELX 4 0 5 لاستبدال وسط استزراع الخلايا بـ 20 µL من محلول HBSS assay. Buffer في كل بئر. بعد ذلك، قم بتحضير flus في محلول التحميل 2:00 AM D عن طريق طرد مركزي قصير للأنبوب لإذابة 50 µg من مسحوق flus in two في 100 µL من DMSO anhydrous.

أضف الآن 50 µL من محلول onic F1 27 DMSO بتركيز 20% weight per volume إلى الصبغة. اخلطهما عن طريق السحب والضخ برفق باستخدام الماصة. ثم أضف 150 µL من flus in 2:00 AM onic F1 27 إلى 35 mL من محلول HBSS assay, buffer واخلط برفق.

بعد ذلك، أضف 20 µL من منظم تحميل الصبغة إلى كل بئر يحتوي بالفعل على 20 µL من HBSS assay.Buffer. حضّن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة تقريبًا بينما يتم تحميل الصبغة في الخلايا. قم بتجهيز لوحة تحفيز الثاليوم عن طريق إذابة 0.5 g من بيكربونات الصوديوم حديثًا في 50 mL من منظم تحفيز الثاليوم بتركيز خمسة أضعاف.

ثم أضف 50 µL من المحلول إلى كل بئر من ألواح البولي بروبيلين ذات 384 بئرًا. بعد تحميل الخلايا بالفلورسنت في غضون 2:00 دقيقة، اغسل اللوحة باستخدام غسالة الأطباق الدقيقة ELX 405. بعد ذلك، أضف 20 µL أو 40 µL من منظم HBSS assay. Buffer إلى كل بئر، وتصبح اللوحة الآن جاهزة للتجارب.

ضع ألواح الثاليوم والخلايا في نظام Hema Matsu لفحص الأدوية الوظيفية أو قارئ ألواح تصوير حركي مكافئ مزود بإمكانيات توزيع السوائل المدمجة، واستخدم المرشحات المناسبة للأصباغ القائمة على الفلوريسين مثل flu oh four. بعد ذلك، قم بإعداد بروتوكول إضافة واحدة لإضافة 10 µL من سلسلة الثاليوم بتركيز five X إلى الآبار المقابلة في لوح الخلايا الذي يحتوي على 40 µL من منظم HBSS assay buffer. ثم سجل الفلورة المرجعية بتردد أخذ عينات 1 Hz لمدة 10 ثوانٍ على الأقل.

يجب أن يكون الفلورسنت بين الآبار موحدًا ومستقرًا عبر اللوحة بمجرد تحديد الظروف المثلى لزرع الخلايا والغسل والتحميل. وفي هذه الأثناء، استخدم الماصة المدمجة ذات الـ 384 قناة لإضافة محلول تحفيز الثاليوم إلى كل بئر في آن واحد، وواصل التسجيل لمدة دقيقتين على الأقل لضمان رصد معدل وذروة الزيادة في الفلورسنت الناتجة عن الثاليوم من أجل التحليل اللاحق. وفي سلسلة التجارب التالية، قم بتقييم مدى توحد وتكرارية المقايسة عن طريق زرع مثبط ضابط في بئر تلو الآخر في كل عمود وصف من لوحة ذات 384 بئرًا، وأضف DMSO إلى الآبار الأخرى كضابط للمذيب.

استخدم ماصة متعددة القنوات. قم بإعداد لوحة DMSO للمركبات عن طريق سحب مثبط لقناة KIR المستهدفة بالتركيز الذي تم تحديده مسبقاً بمقدار 80 µL لكل بئر، وسحب ناقل DMSO بتركيز 0.1% في لوحة بولي بروبيلين تحتوي على 384 بئراً. يتم ذلك بإضافة مثبط معروف بدءاً من البئر A1، وبالتناوب مع البئر B2، وهكذا وصولاً إلى البئر B24.

كرر هذا الإجراء باستخدام DMSO بدءاً من البئر B1 وهكذا وصولاً إلى البئر A24. الآن، قم بتحميل أطباق الخلايا والمركبات ومحفز الثاليوم في قارئ الأطباق. ثم قم بإعداد بروتوكول إضافة مزدوجة لإضافة 20 µL من سلسلة المركبات بتركيز 2X إلى الآبار المقابلة في طبق الخلايا الذي يحتوي على 20 µL من منظم HBSS.

أضف المركبات إلى لوحة الخلايا واتركها للحضانة لمدة تصل إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. سجل التدفق الأساسي للفلورة لمدّة 10 ثوانٍ على الأقل. ثم أضف 10 µL من منظم الثاليوم بتركيز 5x إلى كل بئر من آبار لوحة الخلايا.

كرر التجربة على مدار ثلاثة أيام متتالية لإثبات إمكانية تكرار النتائج. استخدم تدفق الثاليوم في DMSO والخلايا المعالجة بالعقار لحساب قيمة Z prime. ولتحديد مقياس إحصائي لتباين الآبار بين مجموعتي الآبار، احسب Z prime باستخدام هذه الصيغة بناءً على المتوسطات والانحرافات المعيارية لـ P و N، حيث تمثل P قيمة التدفق غير المثبط وتمثل N قيمة التدفق المثبط تماماً.

يعتبر الاختبار الذي تبلغ فيه قيم ZPrime 0.5 أو أكثر على مدار ثلاثة أيام منفصلة مناسباً للفحص عالي الإنتاجية. تمثل هذه الأشكال بعض الأمثلة على خرائط توزيع الخلايا في الأطباق المستخدمة في أنواع مختلفة من التجارب. وتُشار مواقع الآبار التي تحتوي على خلايا غير محفزة أو خلايا محفزة بالتتراسايكلين بألوان مختلفة.

يوضح هذا الشكل مخطط لوحة المصدر المستخدم لتحديد التركيز الأمثل للثاليوم من أجل تطوير المقايسة وفحص المركبات. يمثل التدرج اللوني سلسلة تخفيف ثلاثية تتراوح من 100% إلى 0.002% من الثاليوم، وتظهر هنا خريطة ممثلة لشدة الفلورسنت بألوان تتدرج من الباردة إلى الساخنة، مما يشير إلى قيم تدفق الثاليوم من المنخفضة إلى العالية. يُستخدم مخطط توزيع الخلايا الموضح هنا مع ملاءمة دالة لوجستية ذات أربعة معلمات لمنحنى الاستجابة للتركيز (CRC) للثاليوم لتحديد قيمة EEC 80 قدرها 15% من الثاليوم.

يوضح هذا الشكل مخطط الصفيحة المصدرية المستخدم لتحديد مدى تحمل المقايسة لـ DMSO. يحتوي العمودان 1 و24 على محلول منظم للمقايسة فقط، بينما يشير التدرج اللوني إلى سلسلة تخفيفات بمقدار ضعفين تتراوح من 10% إلى 0.01% من DMSO، وهنا تظهر خريطة تمثيلية لكثافة الفلورة حيث يُشار إلى قيم تدفق الثاليوم المنخفضة باللون الأزرق الداكن. وتلخص هنا متوسط قيم تدفق الثاليوم المسجلة من الآبار التي تحتوي على التركيزات المحددة من DMSO.

يوضح هذا الشكل خريطة الطبق المصدر المستخدمة لإنشاء منحنيات الاستجابة للتركيز للمثبطات المعروفة لقناة KIR. يتم الإشارة إلى كل مركب بلون مختلف، ويتم وضعه عادةً في سلسلة تخفيف ثلاثية. تظهر هنا خريطة تمثيلية لشدة الفلورة، ويوضح هذا الشكل التثبيط المعتمد على الجرعة لتدفق الثاليوم بواسطة المثبط After بعد تطويره وتحسينه.

يمكن استخدام مقايسة تدفق الثاليوم أيضاً لإجراء مجموعة متنوعة من مقايسات علم الأدوية الروتينية. وقد تم تكييف مقايسة تدفق الثاليوم سابقاً للاستخدام مع قنوات البوتاسيوم المعتمدة على الجهد والمربوطة، وقنوات الكاتيونات غير الانتقائية، وحتى ناقلات البوتاسيوم. لا تنسَ أن العمل مع الثاليوم يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات، مثل استخدام القفازات والتخلص المناسب من النفايات، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.