تحويل لالتقاط ELISA لفحص xMAP Luminex باستخدام فحص الجسم المضاد الطريقة ملتيبليكس

يتمثل الهدف العام من التجربة التالية في تحويل مقايسة Eliza محسنة مسبقاً للسيتوكين TNF Alpha إلى منصة Xap مع تقييم أزواج بديلة من الأجسام المضادة. ويتحقق ذلك عن طريق ربط الجسم المضاد للإمساك من طقم ELIZA، إلى جانب ثلاثة أجسام مضادة مرشحة أخرى للإمساك، بأربع مجموعات مختلفة من الكريات المجهرية أو الخرز عند خلطها معاً. وتسمح هذه المجموعات الأربع بالاختبار المتزامن لجميع المرشحين الأربعة باستخدام أربعة أجسام مضادة كاشفة منفصلة لتحديد أفضل زوج من الأجسام المضادة.

يتم بناء اختباري Xap التاليين باستخدام زوجين من الأجسام المضادة الأكثر مثالية. ثم تُقارن كفاءة هذه الاختبارات بكفاءة اختبار EISA الأصلي من حيث قوة الإشارة، والنطاق الديناميكي، والحساسية. وتظهر النتائج أن الأجسام المضادة المتشابهة يمكن أن تؤدي أداءً مختلفاً تماماً تحت الظروف نفسها، وأنه يمكن فحص عدة أجسام مضادة في وقت واحد باستخدام اختبار Luminex Xap، مما يكشف أن هذا الاختبار يتمتع بحساسية ونطاق ديناميكي أكبر مقارنة باختبار EISA.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل EIS A في أن المقايسات المناعية القائمة على xap تسمح للباحث باختبار أهداف متعددة، أو كما هو الحال في هذه الحالة، اختبار أجسام مضادة متعددة في آن واحد. ولتحديد أفضل جسم مضاد تم إثباته، ستقوم إريكا لوبيز، وهي عالمة مشاركة في شركة Luminex Corporation، بشرح الإجراء.

ابدأ هذا البروتوكول باختيار وتحضير أربعة أجسام مضادة للاصطياد وأربعة أجسام مضادة للكشف خاصة بـ human TNF alpha كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بالإضافة إلى ذلك، قم بتحضير جسم مضاد تأكيدي واحد خاص بنوع المضيف للأجسام المضادة للاصطياد. اترك الكواشف الموجودة في طقم ربط الأجسام المضادة لتصل إلى درجة حرارة الغرفة.

قم بتمييز أربعة أنابيب تفاعل بأرقام مناطق الخرز المختارة لتفاعل الاقتران. انقل محتويات القوارير الأربع من الكرات المجهرية mag plex إلى أنابيب التفاعل الأربعة المميزة. اغسل كل مجموعة من الخرز مرتين في 500 µL من محلول التنشيط المنظم، ثم قم بتنشيط كل مجموعة خرز باستخدام محاليل sulf ONHS وEDC كما هو موضح في طقم اقتران الأجسام المضادة.

دليل المستخدم: بعد تحضين لمدة 20 دقيقة على جهاز تدوير (rotator)، كرر خطوة الغسيل السابقة باستخدام الخرزات المنشطة الآن لثلاث مرات إجمالاً باستخدام 500 µL من محلول التنشيط المنظم (activation buffer). لكل عملية غسيل، جهز أربعة محلول منفصلة بحجم 500 µL، يحتوي كل منها على 7.5 µg من الأجسام المضادة للامساك بمحلول تعطيل منظم (capture antibody inactivation buffer).

أضف محاليل الأجسام المضادة الماصة الأربعة هذه إلى أنابيب التفاعل الخاصة بكل منها. قم برج كل أنبوب باستخدام جهاز الرج (Vortex) فوراً، ثم حضنها لمدة ساعتين على جهاز تدوير (rotator). كرر خطوة الغسل للخرز المقترن الآن ثلاث مرات إجمالاً باستخدام 500 µL من محلول الغسل المرفق مع طقم اقتران الأجسام المضادة.

بعد خطوة الغسيل النهائية، أضف 500 µL من محلول الغسيل المنظم إلى كل أنبوب تفاعل للحصول على تركيز مخزون نهائي يبلغ 5 مليون خرزة مقترنة بالأجسام المضادة لكل mL، ثم قم برج الأنابيب باستخدام جهاز الـ vortex، وبعد ذلك استخدم جهاز الموجات فوق الصوتية (sonication) لأنابيب التفاعل لتشتيت الخرزات. قم بعدد الخرزات المستعادة بعد تفاعل الاقتران باستخدام عداد الخلايا أو مقياس كرات الدم (hemo cytometer). عادة ما تتجاوز نسبة الاستعادة من تفاعل الاقتران 90%. تحقق من نجاح تفاعل الاقتران عن طريق تحضير محاليل اختبار لمخزونات الخرزات المقترنة لكل مجموعة بتركيز نهائي يبلغ 100 خرزة لكل µL في محلول المقايسة المنظم، وقم بتحضير تخفيفات من FICO erything المسمى antis species.

يتم تخفيف الجسم المضاد التأكيدي IgG بتركيز 4 µg/mL في محلول منظم للمقايسة، ثم تُنقل أجزاء بحجم 50 µL من كل محلول اختبار إلى أربعة آبار في طبق ذي قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً، ليصل المجموع إلى 16 بئراً. بعد ذلك، يُضاف 50 µL من المحلول المنظم للمقايسة إلى ثمانية من الآبار لقياس الخلفية، و 50 µL من الجسم المضاد التأكيدي المخفف إلى الآبار الثمانية المتبقية. تُخلط التفاعلات برفق عن طريق السحب والدفع بالماصة عدة مرات باستخدام ماصة متعددة القنوات.

قم بتغطية الطبق وتحضينه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على هزاز أطباق. ضع الطبق على فاصل مغناطيسي للأطباق لمدة دقيقة إلى دقيقتين لسحب الخرز من المحلول. ثم قم بإزالة السائل عن طريق قلب الطبق بقوة أثناء وجوده على الفاصل فوق وعاء النفايات.

اغسل كل بئر مرتين عن طريق إضافة 100 µL من منظم المقايسة (assay buffer) وإزالة SANE من اللوحة بطريقة مماثلة. باستخدام فاصل اللوحة المغناطيسي، أعد تعليق الخرزات في 100 µL من منظم المقايسة عن طريق السحب والضخ بلطف باستخدام ماصة متعددة القنوات لخمس مرات. قم بالتحليل باستخدام جهاز luminex xap مثل جهاز magix.

تتناسب شدة الإشارة الفلورية لهذا التفاعل تناسباً طردياً مع كمية البروتين الموجودة على سطح الخرزات، مما يتيح تقييماً سريعاً للكمية النسبية للبروتين المقترن بالخرزات. ولتحديد الزوج الأكثر فاعلية من الأجسام المضادة في مقايسة xap، قم بتحضير مزيج أولي من مجموعات الخرزات الأربع عن طريق إضافة 10 µL من كل منها إلى 0.96 mL من محلول منظم المقايسة. قم بتحضير محاليل الأجسام المضادة الكاشفة عن طريق تخفيف كل جسم مضاد ليصل تركيزه إلى 1 µg/mL في محلول منظم المقايسة.

وهو يعمل أيضاً كمحلول منظم للمقايسة. قم بتحضير المعيار البروتيني TNF alpha من شركة r and d systems بتركيز 2000 picograms per milliliter، وخفف Streptavidin R FICO eryn إلى تركيز eight micrograms per milliliter. أضف 50 microliters من خليط الخرز المقترن بالأجسام المضادة إلى كل بئر من الآبار الـ 16 في طبق CoStar Round bottom ذو 96 بئراً لإجراء مقايسة الفرز.

بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول منظم المقايسة (assay buffer) إلى ثمانٍ من الفجوات الـ 16 لقياس الخلفية. ثم انقل 50 µL من معيار TNF alpha إلى الفجوات الثماني الأخرى لقياس الاستجابة. يتم التحضين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء وأثناء الرج على هزاز أطباق المقايسة.

بعد ذلك، أضف 50 µL من كل من الأجسام المضادة للكشف الأربعة إلى أربعة آبار، بحيث يكون اثنان منها آبار خلفية (background wells)، واثنان آبار استجابة (response wells). قم بالتحضين لمدة 30 دقيقة تحت نفس الظروف، ثم أضف 50 µL من كاشف SAPE إلى جميع الآبار. قم بالتحضين مرة أخرى لمدة 15 دقيقة تحت نفس الظروف.

ضع الطبق على فاصل مغناطيسي للأطباق لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بإزالة السائل عن طريق قلب الطبق بقوة وهو لا يزال على الفاصل فوق وعاء النفايات. استخدم الماصة لنقل 100 µL من محلول التخزين الخاص بالمقايسة إلى كل بئر من الآبار الـ 16.

ثم قم بإزالة السائل من الخرزات باستخدام الفصل المغناطيسي. بعد ذلك، أضف 100 µL من منظم المقايسة إلى كل بئر من الآبار الـ 16. اقرأ اللوحة باستخدام جهاز Luminex mag picks مع الرجوع إلى دليل المستخدم لضمان التشغيل الصحيح.

اختر زوجاً من الأجسام المضادة الذي يحقق قوة الإشارة المطلوبة. بعد اختيار أفضل جسم مضاد للاقتناص، خفف 100 microliters من مخزون الخرز المقترن بهذا الجسم المضاد إلى 10 milliliters باستخدام محلول منظم للمقايسة. أضف 50 microliters من الخرز المخفف إلى 78 بئراً في لوحين من ألواح CoStar ذات القاع المستدير التي تحتوي على 96 بئراً.

سيتم استخدام كل طبق لتقييم أداء جسم مضاد كاشف مختلف. بعد ذلك، قم بإعداد منحنى قياسي مكون من 12 نقطة يبدأ من 8,000 picograms per milliliter وينتهي عند four picograms per milliliter، وذلك باستخدام أنظمة r and d systems.

أضف ست مكررات بحجم 50 microliter من كل تخفيف من معيار TNF Alpha إلى كل لوحة، بالإضافة إلى ست آبار تحتوي كل منها على 50 microliter من محلول منظم المقايسة (assay buffer) كخلفية، ليصبح المجموع 78 بئراً لكل لوحة. حضن اللوحات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع حمايتها من الضوء أثناء الرج على هزاز ألواح المقايسة. بعد ذلك، أضف 50 microliter من الجسم المضاد للكشف الأول إلى جميع الآبار الـ 78 في اللوحة الأولى.

كرر العملية للأجسام المضادة الكاشفة الثانية في اللوحة الثانية. قم بتحضين اللوحات لمدة 30 دقيقة تحت نفس الظروف. ثم أضف 50 µL من كاشف SAPE إلى جميع آبار كل لوحة.

بعد رج اللوحين لمدة 15 دقيقة مع الحماية من الضوء، ضع الألواح على فواصل مغناطيسية لمدة دقيقة واحدة. تخلص من السائل عن طريق قلب اللوح بقوة أثناء وجوده على الفاصل فوق وعاء النفايات. بعد ذلك، انقل 100 µL من منظم المقايسة (assay buffer) إلى كل بئر من الآبار الـ 78 الموجودة في الألواح قبل إزالة السائل من الخرزات المغناطيسية كما سبق.

بعد إضافة 100 µL من محلول التخزين الخاص بالمقايسة (assay buffer) إلى الخرزات في كل من الآبار الـ 78 الموجودة على الأطباق، قم بتحليل الأطباق باستخدام جهاز mag picks بالرجوع إلى دليل المستخدم لضمان التشغيل الصحيح. اتبع التعليمات المرفقة مع مجموعة r and d systems، الخاصة بطقم ELI A لـ human TNF Alpha T NF SF one a DUO. قم بقياس الاستجابة الناتجة عن المعيار (standard) الموفر مع طقم r and d.

كرر مقايسة ELI a ثلاث مرات إضافية مع استبدال أجسام الالتقاط والكشف المضادة من شركة r and d systems بالأجسام المضادة من الموردين الآخرين. وللتبسيط، قم بزوج الأجسام المضادة حسب المورد، وقيم كل زوج بشكل مستقل كما يتطلبه تنسيق EISA مع كل معيار من معايير بروتين TNF Alpha الثلاثة. أُجريت مقايسات Luminex Xap كتحليل متعدد لتقييم جميع أجسام الالتقاط المضادة الأربعة كمزيج عن طريق دمج أربع مجموعات من أجسام TNF alpha المضادة المقترنة بـ Mag PLX microspheres، حيث تم تقييم أجسام الالتقاط المضادة مع كل جسم من أجسام الكشف المضادة الأربعة المبيوتنة بشكل فردي، بحيث يمكن تحديد تفاعل جسم كشف مضاد واحد مع كل من أجسام الالتقاط المضادة الأربعة في وقت واحد.

أشارت النتائج إلى أن زوج الأجسام المضادة من مجموعة r and d systems DUO حقق أفضل أداء، حيث بلغت الاستجابة الناتجة 6,183 وحدة من متوسط شدة الفلورة أو MFI. كما لوحظ أن الأجسام المضادة الكاشفة من Millipore و ABAM قدمت استجابة معقولة في مقايسة XAP عند دمجها مع الجسم المضاد الالتقاطي من RD systems، بينما أنتجت الأجسام المضادة الالتقاطية من Millipore و ACAM و Novus استجابة أقل رغبة في مقايسة XAP. وقد استُخدم بروتوكول مجموعة r and d systems DUO لمقارنة أزواج الأجسام المضادة الأربعة بتنسيق EISA.

استُخدم بروتوكول r and d systems مع جميع أزواج الأجسام المضادة لأنه يعكس بروتوكولات EIA النموذجية المستخدمة على نطاق واسع اليوم، وهو مشابه للبروتوكولات المستخدمة مع تقنية xap. وأظهرت اختبارات EISA أن زوج الأجسام المضادة من r and d systems قد أعطى أفضل النتائج مرة أخرى. ولم ينتج زوج الأجسام المضادة من Acam أي استجابة، بينما أنتجت أزواج الأجسام المضادة من Millipore و Novas استجابات متواضعة وذلك لتقييم أي تفاوت في تفاعلية الأجسام المضادة.

باستخدام المعيار، تم اختبار جميع أزواج الأجسام المضادة الأربعة باستخدام ثلاثة معايير مختلفة من بروتين TNF alpha المؤتلف من ثلاثة موردين مختلفين. وتظهر البيانات أن معايير بروتين TNF alpha المؤتلف من الموردين الثلاثة أعطت نتائج متكافئة. وقد استُخدم بروتين TNF alpha من r and d systems لإنشاء منحنيات قياسية باستخدام مقاييس ELSA و XAP.

بينما تم إجراء مقايسة ELI A باستخدام زوج الأجسام المضادة من شركة r and d system، فقد استخدمت مقايسات xap الجسم المضاد الالتقاطي من شركة r and d system وإما الجسم المضاد الكاشف من شركة r and d systems أو شركة Millipore. تم تخفيف بروتين TNF alpha من شركة r and d systems لإنتاج نطاق من التركيزات يتراوح من 8, 000 إلى 4 pg/mL فقط. وقد أنتج زوج الأجسام المضادة من شركة r and d systems النتيجة المتوقعة في مقايسة Xap باستجابة تزيد عن 20, 000 MFI كما هو موضح.

عند استخدام الجسم المضاد للكشف من شركة Millipore في مقايسة Xap بدلاً من الجسم المضاد للكشف من شركة r and d systems، كانت الاستجابة حوالي 30% من الاستجابة التي تم الحصول عليها باستخدام الجسم المضاد للكشف من شركة RD systems. يمثل الخط الأخضر في هذا المخطط المنحنى القياسي لمقايسة ELA، والتي كان النطاق الموصى به من الشركة المصنعة لـ TNF alpha فيها من 16 إلى 1000 picograms per milliliter. وبسبب حدود جهاز المطياف الضوئي، لم يكن من الممكن زيادة نطاق مقايسة Eliza.

علاوة على ذلك، يظهر النطاق الديناميكي والحساسية لكلا الطريقتين بشكل أوضح عند تمثيلهما بمقياس لوغاريتمي. ويمكن ملاحظة فرق واضح بين ميل استجابة EISA والاستجابات الناتجة عن مقايسات xap، مما يشير بشكل أكبر إلى قدرة أكثر محدودية للكشف عن TNF alpha باستخدام EL iza عند التركيزات المرتفعة والمنخفضة على حد سواء. وقد تم تقدير حدود الكشف أو LOD لمقايسات TNF alpha xap الوظيفية من خلال تحديد أدنى تركيز لـ TNF alpha يكون مستوى الاستجابة الملحوظ له أكبر من مستوى الخلفية، مضافاً إليه ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري أو SD من ست مكررات.

يمكن ملاحظة أنه عند استخدام زوج R&D Systems، فإن أدنى تركيز لـ TNF alpha عند 3.91 picograms per milliliter قد أنتج استجابة قدرها 66 MFI، وهي قيمة أكبر من الاستجابة الخاصة بالخلفية زائد ثلاثة SD، وبذلك يستوفي هذا المعيار. أما عند استخدام جسم مضاد للكشف من Millipore مع جسم مضاد للاحتجاز من R&D Systems، فقد كان حد الكشف أقل من 7.81 picograms per milliliter.

في هذه الحالة، كان ثاني أدنى تركيز لـ TNF alpha قد أنتج استجابة مقبولة بلغت 17 MFI، وهي قيمة أكبر من الاستجابة الناتجة عن أدنى تركيز لـ TNF alpha مضافاً إليها ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري الخاص به. وبالمثل، قُدّر حد الكشف لمجموعة r and d systems duo set Eliza بأن يكون بين 63 و 31 picograms per milliliter. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ خطوات أخرى مثل اختبار مصفوفات عينات متنوعة أو تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة في الكاشف (reporter) من أجل تحسين مقايسة xap بشكل أكبر.