خلق بيئات الغازية محددة لدراسة تأثير نقص الأكسجة في

تهدف التجربة التالية إلى إعداد وصيانة غرفة نقص أكسجة (hypoxia chamber) باستخدام طريقة التدفق المستمر. ويتم تحقيق ذلك من خلال توفير وتصنيع الأنابيب والدوارق والغرف اللازمة للإجراء. وكخطوة ثانية، يتم توصيل أسطوانة الأكسجين واختيار معدل التدفق لإنشاء المستوى المطلوب من نقص الأكسجة.

قم بترطيب الغاز عن طريق تمريره عبر دورق فقاعات مملوء بالماء منزوع الأيونات. قم بتوصيل الغاز المرطب بغرفة نقص الأكسجين وضع العينات المختبرة في الغرفة لتعريضها لظروف نقص الأكسجين. يتم الحصول على نتائج تظهر летаليت جنينية في حالة نقص الأكسجين تعتمد على Hi F1 بناءً على ملاحظة القدرة على البقاء حتى مرحلة البلوغ.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الصناديق القفازية (glove boxes)، في سهولة ورخص تصنيعها داخل المختبر، وتوفيرها لتركيز دقيق وقابل للتكرار للغازات في غرفة البيئة. وبينما توفر هذه الطريقة نظرة متعمقة في الاستجابة لنقص الأكسجة في دودة *C. elegance*، يمكن أيضاً تطويعها لأنظمة أخرى، بما في ذلك الكائنات النموذجية الأكبر وزراعة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامها لدراسة غازات أخرى، بما في ذلك ثاني أكسيد الكربون وكبريتيد الهيدروجين.

يوضح هذا البروتوكول كيفية إنشاء غرفة نقص الأكسجين (hypoxia chamber). يُخزن الغاز في أسطوانات غاز مضغوطة بتركيزات أكسجين محددة، مع توصيل منظم ضغط ثنائي المرحلة. يدخل الغاز من الجزء السفلي لأنبوب التدفق، ثم يخرج من الأعلى بمعدل تدفق صحيح.

يتدفق الغاز بعد ذلك إلى دورق الفقاعات لترطيب الغاز. ثم يمر الغاز المرطب إلى غرفة نقص الأكسجة عند صمام التدفق، مما يعرّض العينات لنقص الأكسجة. وأخيرًا، يتم تصريف الغاز إلى الغرفة عبر فتحة عادم محفورة في الغرفة.

يمكن استخدام وعاء تبلور من نوع Pyrex أو صندوق عبوات الأسهم كهيكل لغرفة البيئة. يجب الحفاظ على حجم الحاوية في حدوده الدنيا، كما يجب أن تكون المادة غير نفاذة للغازات. قم بثقب فتحة في أحد جوانب الحاوية باستخدام مثقاب ذو رأس كربوني أو ماسي، ثم قم بتركيب وصلة خرطوم بلاستيكية (hose barb fitting).

اخلط راتنج الإيبوكسي قبل تطبيقه على الصندوق والوصلة. ثم كرر الإجراء نفسه على الجانب المقابل للحاوية مع إزاحة الثقب الثاني عن الأول. ولزيادة الخلط الاضطرابي، استخدم أنابيب FEP أو نايلون بقطر خارجي يبلغ one eighth inch لتوصيل خزانات الغاز المضغوط بجهاز التحكم في التدفق، مثل متحكم تدفق الكتلة أو مقياس التدفق الدوار (rotor meter).

يجب أن تحتوي خزانات الغاز على تركيزات محددة من الأكسجين متوازنة مع النيتروجين، والتي تكون بمثابة معيار معتمد لمحتوى الأكسجين أو للظروف اللاهوائية. عند استخدام النيتروجين النقي، استخدم منظمًا ثنائي المرحلة مع ضبط المرحلة الثانية على الضغط المطلوب. راجع التعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب لاختيار معدل تدفق مناسب.

ثم قم بتوصيل الأنبوب من المنظم ثنائي المرحلة إلى أنبوب التدفق الذي يتحكم في معدل تدفق الغاز الداخل إلى الغرفة. يتم توصيل مخرج أنبوب التدفق بزجاجة غسل الغاز ذات أسطوانة مسامية تحتوي على ماء مقطر. بعد ذلك، قم بتوصيل الأنبوب الموجود على الجانب الآخر من زجاجة الغسل بأحد وصلات الغرفة البيئية.

سيؤدي ذلك إلى ترطيب الغاز الداخل إلى الغرفة البيئية. استخدم شحم التفريغ (vacuum grease) لإحكام إغلاق الغرفة، ثم ضع أثقالاً على غطاء الغرفة لضمان إحكام الغلق ضد الهواء.

اختبر السدادات عن طريق وضع كمية صغيرة من الماء في راحة يد ترتدي قفازاً على وصلة عادم الغاز في الغرفة والتحقق من وجود فقاعات. أولاً، قم بتوليد مجموعات متزامنة من ديدان sea Elgan. ضع من 1 إلى 100 من البالغين من نوع GR في قطرة من محلول مبيض قلوي على سطح طبق وسط نمو للنيماتودا غير مزروع.

اترك محلول المبيض ليمتصه الطبق بعد فترة تحضين لا تقل عن ثماني ساعات. انقل يرقات L1 المتزامنة إلى طبق مزروع ببكتيريا OP 50 الحية. وبدلاً من ذلك، اسمح للبالغين من سلالة GRA بوضع البيض على الطبق لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات لتوليد مجموعة من الديدان التي ستنمو بشكل متزامن، أو اختر يرقات L4 من مجموعة مختلطة لجمع أجنة صغيرة.

في مرحلة الخليتين إلى أربع خلايا، استخدم شفرة حلاقة لتقطيع ديدان GR البالغة في حجم صغير من الماء، ثم انقل الأجنة باستخدام ماصة فموية قبل نقل الديدان إلى الطبق لتعريضها لظروف نقص الأكسجة. ضع حلقة من حمض البالمتيك بتركيز 10 milligram per milliliter في الإيثانول حول حافة الأطباق، وذلك لمنع الديدان من الهروب من سطح طبق الآجار.

سوف يترسب حمض palmitic acid من المحلول. وبينما يتبخر الإيثانول مكوناً حاجزاً فيزيائياً لضمان التجانس، تأكد من استبدال الماء في زجاجة غسل الغاز قبل التعريض في الغرفة البيئية. بعد نقل الديدان إلى الأطباق، أحكم إغلاق الأطباق في الغرفة البيئية، وابدأ تدفق الغاز، وحافظ على التعريض للمدة المطلوبة للفحص.

لضمان حيوية الأجنة حتى مرحلة البلوغ، تُترك الديدان لتنمو لمدة 48 ساعة بعد العودة إلى هواء الغرفة، وفي هذه المرحلة يجب أن تكون في طور اليرقات من المرحلة الرابعة أو بالغة لمدة يوم واحد لتقييم الحيوية حتى مرحلة البلوغ. ولتصوير الديدان التي تعرضت لنقص الأكسجة، تُنقل الديدان إلى قطرة من M nine على غطاء شريحة مربع بمقاس 22 مليمتر، وتُقلب فوق وسادة من 2%aros في M nine إذا لزم الأمر.

يمكن استخدام 25 millimolar من amol أو 10 millimolar من azide sodium كمخدر. وبدلاً من ذلك، بعد التعرض لنقص الأكسجين، يمكن وضع غرفة البيئة الشفافة مباشرة على منصة مجهر التشريح. يتم عرض منظرين، أحدهما يتضمن إعداد تدفق الغاز بالكامل.

والآخر مع الغرفة فقط على منصة المجهر. قم بتربية ديدان Bristol N2 على أربعة أطباق نمو بقطر 10 سنتيمتر حتى تصبح غالبية الديدان في مرحلة البلوغ (GR adults). اغسل الديدان في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليليتر باستخدام محلول مبيض قلوي بنسبة 1 إلى 5، ثم حضنها مع التدوير حتى تبدأ الديدان في التحلل.

لمدة لا تزيد عن خمس دقائق. تُغسل الديدان ثلاث مرات باستخدام M9 مع الترسيب بالدوران بسرعة 1,500 ×g بين كل غسلة ودون استخدام صفائح مكسورة. تُوزع الأجنة المبيّضة على 8 صفائح NGM بقطر 150 مليمتر، وتُترك الأجنة لتنمو حتى تصل إلى مرحلة اليرقات L4 لمدة 48 ساعة تقريبًا.

عند درجة حرارة 22 درجة Celsius، انقل الأطباق إلى الغرفة البيئية وعرّضها لظروف نقص الأكسجة (hypoxic) واللانقصية (anoxic) لمدة أربع ساعات أو للمدة المحددة في التصميم التجريبي. ولجمع العينات، قم بإزالة غطاء غرفة نقص الأكسجة بسرعة. خذ طبق عينة واحدًا ثم أعد إغلاق الغرفة وسجل الخطوات.

بعد إخراج الديدان من حالة نقص الأكسجة، يجب أن تستغرق هذه العملية بأكملها أقل من دقيقتين. استخدم الماء المقطر لغسل الديدان على مرشح نايلون، ثم اسكبها في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter محدد مسبقاً يحتوي على 100 µL من SDS بتركيز 1%. يتم طرد الديدان الموجودة في SDS مركزيًا باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي بسرعة 1,500 ×g لمدة 15 إلى 20 ثانية.

باستخدام جهاز طرد مركزي، استخدم vacuum لإزالة معظم السائل الطافي من الأنبوب، مع ترك كتلة الديدان دون مساس. وباستخدام ماصة، انقل كتلة الديدان مع حجم محدد مسبقاً من السائل إلى أنبوب 1.5 micro refuse مُصنف. إذا كانت العينة ستُستخدم في SDS page، يمكن أن يحتوي هذا الأنبوب على حجم مساوٍ من صبغة تحميل البروتين بتركيز ضعفين (two times protein loading dye)؛ أغلق الأنبوب ثم اغمره في النيتروجين السائل.

كرر العملية حتى يتم عزل جميع العينات. اتبع هذه الإجراءات مع عينات التحكم في هواء المنزل لضمان الاتساق؛ ويمكن تخزين العينات عند درجة حرارة -20 °C. يوضح هذا الشكل حيوية الأجنة المعرضة لـ 1000 parts per million من الأكسجين، و5,000 parts per million من الأكسجين، وحالة سويّة الأكسجة (normoxia) عند حوالي 210,000 parts per million من الأكسجين.

تُعرّض الأجنة لكل حالة لمدة 24 ساعة في غرف أكسجين ذات تدفق مستمر. نُقلت الديدان إلى ظروف طبيعية الأكسجين (normoxic) وسُمح لها بالنمو حتى مرحلة البلوغ لمدة 48 ساعة، ثم تم تقييم قدرتها على البقاء حتى البلوغ. بعد هذا الإجراء، يمكن جمع العينات لإجراء تحليلات لاحقة عن طريق Western blot أو QPCR أو الاختبارات الفسيولوجية مثل قياس فترة الحياة أو إنتاج النسل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إعداد غرفة نقص الأكسجين ذات التدفق المستمر في مختبرك الخاص.