استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس نشاط قنوات البوتاسيوم KV seven في خلايا العضلات الملساء للشرايين المساريقية المفككة حديثاً، وربط ذلك بقياسات قطر الشرايين المسجلة تحت الظروف الفسيولوجية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة القوس الوعائي المساريقي جراحياً من الجرذ. وتتمثل الخطوة الثانية في تشريح وتنظيف قطع من الشرايين المساريقية.

بعد ذلك، تُستخدم بعض القطع لعزل خلايا عضلية ملساء فردية لإجراء قياسات فيزيولوجية كهربائية باستخدام تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) لتيارات البوتاسيوم KV seven. وتتمثل الخطوة النهائية في إدخال قنيات في قطع شريانية سليمة لإجراء قياسات تخطيط العضلات بالضغط (pressure myography) لتقييم انقباض أو تمدد الشرايين استجابةً للمعدِّلات الدوائية لقنوات البوتاسيوم KV seven. وفي النهاية، يُستخدم الجمع بين الفيزيولوجيا الكهربائية بتقنية تثبيت الرقعة وتخطيط العضلات بالضغط لتوضيح كيف يؤثر زيادة أو نقصان نشاط قنوات البوتاسيوم KV seven على انقباض الشرايين المساريقية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الحالية، مثل استخدام قنوات مستنسخة يتم التعبير عنها في خطوط خلوية، في أنه يتم تسجيل التيارات من خلايا غير مستزرعة تعبر عن القنوات بشكل طبيعي، كما يمكن عزل تيارات KV عن الفئات الأخرى من قنوات البوتاسيوم التي قد يتم تنشيطها في الخلايا ذاتها. وتسمح تقنية قياس تقلص العضلات بالضغط (pressure myography) بتسجيل الاستجابات الوظيفية من النسيج نفسه الذي اشتُققت منه الخلايا المعزولة، كما أن هذه الطريقة أكثر حساسية وأكثر محاكاة للظروف الفسيولوجية من التحضيرات الأخرى مثل الحلقات الشريانية أو الشرائح الشريانية. وسيقوم الدكتور Bareth Mani، وهو زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح تقنيات القسطرة الشريانية وقياس تقلص العضلات بالضغط، بينما ستقوم الدكتورة Luba Brueggeman، وهي أستاذ مساعد للبحوث في مختبري، بشرح إجراءات عزل الخلايا وتثبيت الرقعة (patch clamp).

لبدء هذا الإجراء، استخدم مقصاً جراحياً لقص قطعة بطول 10 إلى 12 سنتيمتر من كلا طرفي الأمعاء الدقيقة للجرذ. ثم قم بعزل الأمعاء مع الأوعية الدموية المتصلة بها. بعد ذلك، قم بتثبيت قطعة الأمعاء الدقيقة باستخدام دبابيس.

بسط المساريق فوق الجانب القريب من الحجرة بحيث يكون الفرع الرئيسي للشريان المساريقي العلوي في المركز وتتفرع منه الفروع اللاحقة بشكل شعاعي من المركز. بعد ذلك، ضع الدبابيس فقط على القطع المعوية مع المعاينة عبر مجهر تشريحي مضاء. قم بإزالة النسيج الدهني والنسيج الضام المحيط بالشرايين من الرتبة الثانية إلى الرابعة القريبة من الأمعاء بعناية باستخدام ملاقط ومقصات دقيقة.

أمسك الأوردة المجاورة لتسهيل إزالة الأنسجة الدهنية والنسيج الضام وتجنب التمدد غير الضروري للشرايين. الآن، انقل قطعتين إلى ثلاث قطع من الشريان المساريقي إلى طبق زراعة أنسجة مقاس 35 ملم يحتوي على 2 مل من محلول العزل المبرد بالثلج. ضع الطبق على الثلج بعد ذلك، ثم قطع أجزاء الشريان المساريقي إلى قطع بطول 3 إلى 4 ملم باستخدام ماصة PEs ذات طرف مصقول بالنار.

انقل القطع الشريانية إلى قارورة زجاجية تحتوي على 2 mL من محلول العزل المسخن مسبقاً عند 37 °C. ثم قم بتحضينها لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. وبعد مرور 30 دقيقة، اسحب محلول العزل عند 37 °C بعناية باستخدام ماصة باستور.

أضف 2 mL من محلول الإنزيم الدافئ إليه، ثم حضنه لمدة 35 دقيقة عند 37 °C. فور انتهاء فترة التحضين لمدة 35 دقيقة في محلول الإنزيم، ضع الأنبوبة على الثلج، واسحب محلول الإنزيم وأضف 2 mL من محلول العزل المبرد بالثلج. كرر هذه العملية أربع مرات.

بعد ذلك، في 1 مللي لتر من محلول العزل المبرد بالثلج، قم بتكرار تحريك قطع الشرايين برفق باستخدام ماصة خلفية مصقولة من 10 إلى 20 مرة لتحرير خلايا العضلات الملساء الفردية للشريان المساريقي. تحقق من مظهر الخلايا العضلية بشكل دوري عن طريق وضع قطرة من معلق الخلايا على طبق بقطر 35 مليمتر وفحصها تحت المجهر.

يجب أن تظهر خلايا العضلات الملساء للشريان المساريقي (MA SMCs) السليمة بمظهر متطاول وأملس. بعد ذلك، انقل ما يقرب من 100 إلى 200 µL من معلق الخلايا إلى غرفة التسجيل باستخدام ماصة باستير مصقولة، واترك الخلايا تلتصق لمدة 15 دقيقة. في هذه الخطوة، املأ طرف ماصة الرقعة (patch pipette) بالمحلول الداخلي الخالي من amphotericin B عن طريق غمس طرف الماصة فيه.

ثم قم بتطبيق الشفط على الطرف الآخر باستخدام محقنة سعة 10 milliliter متصلة عبر قطعة من الأنابيب، وأضف محلول الماصة من الأعلى. باستخدام ماصة einor micro loader، اسحب المحلول حتى تمتلئ الماصة إلى منتصفها تقريبًا. قم بإزالة أي فقاعات هوائية عن طريق النقر برفق على الماصة.

بعد ذلك، أدخل الماصة في حامل القطب الكهربائي. استخدم جهاز تلاعب دقيق لخفض الماصة حتى تصل إلى سطح خلية عضلية مستطيلة. وعندما تزداد مقاومة الماصة لتصل إلى 6 إلى 10 mega ohms، قم بتطبيق الشفط لتحقيق ختم جيجا (giga seal).

في الوقت نفسه، اضبط جهد التثبيت على صفر millivolts بانتظار ثقب الغشاء. بعد ذلك، قم بتطبيق خطوات جهد مدتها 100 millisecond عند +10 millivolts ثم عند -10 millivolts. استخدم المضخم لتعويض العابر السريع لسعة الماصة المتزامن مع ظهور سعة الخلية الكاملة.

تشير التيارات الموجبة المستمرة الصغيرة والعابرة التي تتراوح قيمتها بين 2 إلى 10 pA من حيث النقاء والسعة إلى وجود قنوات KV7 وظيفية. سيؤدي الثقب الناجح باستخدام amphotericin B إلى تقليل مقاومة الوصول إلى 35 MΩ أو أقل. لتسجيل العلاقة بين الجهد والتيار لقنوات KV7، يتم تطبيق خطوات جهد لمدة خمس ثوانٍ بجهود تتراوح من -84 mV، حيث تكون احتمالية فتح قنوات KV7 في حدها الأدنى، إلى +16 mV، حيث تصل احتمالية فتح قنوات KV7 إلى مرحلة الثبات. وبعد مرور خمس ثوانٍ عند كل جهد اختبار، يتم الرجوع إلى جهد التثبيت عند -4 mV لمدة 10 ثوانٍ.

في هذا الإجراء، يتم تعليق خيطين من خيوط النايلون الدقيقة والمجهزة مسبقاً بشكل مرتخٍ على كل جانب. وبجوار القنية الزجاجية، يتم نقل قطعة الشريان المساريقي المُشرح بعناية من غرفة التشريح إلى غرفة طعم العضلات تحت الضغط، وذلك عن طريق الإمساك بطرف واحد من القطعة باستخدام ملقط دقيق. بعد ذلك، ومع الرؤية من خلال مجهر تشريح مضاء، يتم الإمساك بطرف واحد من قطعة الشريان وتمريرها برفق فوق القنية الزجاجية اليسرى.

قم بتثبيت الطرف باستخدام خيوط النايلون. بعد ذلك، قم بغسل التجويف بلطف بتمرير السائل عبر الوعاء المثبت لإزالة الدم والشوائب. يجب بعد ذلك إغلاق الصمام المتصل بالمحقنة اليسرى بحيث يمثل هذا الجانب عموداً ساكناً من السائل يتم ضبط الضغط مقابلها من الجانب الأيمن، وباستخدام الملاعب الدقيق، قم بتحريك القنية الزجاجية اليمنى القابلة للتحريك لتقريبها من قطعة الشريان ثم اسحب الطرف الأيمن من القطعة فوقها.

أخيراً، قم بتثبيت قطعة الشريان باستخدام غرز النايلون ثم قص خيوط الغرز الزائدة. الآن، قم بتركيب وحدة رسم بياني الضغط على المنصة فوق مجهر تصوير الضغط المجهري. صِل عمود الضغط بالجانب الأيمن من غرفة الرسم البياني، ثم ضع الغطاء فوق الغرفة.

ارفع المحقنة سعة 10 milliliter تدريجياً على مدار 15 دقيقة وتحقق من عدم وجود أي تسريبات في الوعاء الدموي حتى يقرأ محول ضغط P one قيمة 80 millimeters mercury، مع ضبط المسافة بين الكانيولا عند الضرورة؛ إذ يجب ضبط المسافة بحيث يكون الجزء المضغوط من الشريان مستقيماً تقريباً ويشكل نمطاً يشبه الكتف عند نقاط الربط. تحقق من حيوية الوعاء الدموي المثبت عن طريق التروية السطحية العابرة بـ 60 millimolar من potassium chloride لمدة 30 ثانية. ينقبض الوعاء الحي بسرعة مع إضافة potassium chloride ويتوسع فور غسله.

بعد ذلك، أضف المادة المختبرة المركزة إلى محلول الحمام عن طريق سحبها وطرحها بلطف باستخدام الماصة بالقرب من نهاية الحجرة لخلط المادة المختبرة في محلول الحمام، مما يعطي التركيز النهائي المناسب في الحجرة التي سعتها 10 milliliter. يمكن مراقبة التغيرات في الحجم في قطر الوعاء بعد إضافة المادة المختبرة في صورة الفيديو المباشرة وأيضاً رسمها بيانياً في نافذة تحليل الصور أثناء سير التجربة. يوضح هذا الشكل مجموعة من آثار التيار المتتالية التي تم تسجيلها استجابة لخطوات الجهد قبل المعالجة كما هو موضح باللون الأسود، وبعد الاستقرار في وجود 100 nanomolar من zinc perion في خلية عضلية واحدة من الشريان المساريقي كما هو موضح باللون الأحمر؛ وهنا تظهر التيارات التمثيلية للمجموعة الضابطة ولـ 100 nanomolar من zinc perion.

تشير الأشرطة الرمادية إلى الفاصل الزمني الذي قيست فيه متوسطات سعة التيار. وبالنسبة لمخططات التيار والجهد، يشار إلى جهود الخطوة على اليمين برؤوس سهام. هذا هو المخطط الزمني لتعزيز تيار KV7 بواسطة 100 nanomolar من أيون الزنك، والذي تم قياسه باستخدام تثبيت الجهد المستمر عند -20 millivolts. تظهر هنا منحنيات التيار والجهد المتوسطة المشتقة من كثافات تيار KV7 المسجلة قبل وأثناء المعالجة بـ 100 nanomolar من أيون الزنك، وأثناء المعالجة بـ 10 micromolar من غالق قناة KV7 وهو XC 9 9 1، بالإضافة إلى الارتخاء الناجم عن أيون الزنك في الشريان المساريقي الذي تم تضييقه مسبقاً بـ 100 picomolar من الأرجينين فازوبريسين.

يوضح هذا الشكل المخطط الزمني للتغيرات في القطر الخارجي للوعاء الدموي استجابةً لإضافة 100 picomolar من arginine vasopressin، يليه إضافة 100 nanomolar من أيون الزنك. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الشرايين لعزل الخلايا المفردة أو لقياسات pressure myography لتقييم استجابات تضيق وتوسع الشرايين. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تعرف كيفية تسجيل تيارات KV seven بمعزل عن التيارات الأخرى في الخلايا العضلية الشريانية المعزولة حديثاً.