تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تتبع الخلايا التي تم تحويلها ضوئياً في جنين سمكة الزيبرا الحي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق غمر الجنين، الذي يعبر عن بروتين فلوري قابل للتحويل الضوئي ومحدد للنسيج، في أغار منخفض درجة الانصهار. بعد ذلك، يتم تحويل البروتين الموجود داخل المنطقة المستهدفة ضوئياً بشكل كامل.

بعد ذلك، يتم إزالة الجنين بعناية من agarose ويُحفظ في ماء البيض عند 28.5 درجة مئوية حتى الوصول إلى مراحل لاحقة. وأخيرًا، يتم غمر الجنين الذي خضع للتحويل الضوئي مرة أخرى في agarose منخفض درجة الانصهار. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر إمكانية الكشف بدقة عن الخلايا التي خضعت للتحويل الضوئي في المراحل اللاحقة، وذلك بفضل الوجود المستقر للبروتين المحول ضوئيًا من خلال المجهر البؤري (confocal microscopy).

لذا نعتقد أن الطريقة التي سنقدمها اليوم ستكون مفيدة للغاية في سياق بيولوجيا الخلية والبيولوجيا التطورية. ونرى أن استخدام هذه المنهجية في سياق هجرة الخلايا، وديناميكيات الأنسجة، وغيرها من سلوكيات الخلايا سيكون مفيداً جداً. ستقوم بفصل الإجراءات فيرونيكا لومباردو، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري، وذلك بعد تهجين أسماك zebrafish المعدلة وراثياً، والتي تعبر عن بروتين فلوري قابل للتحويل الضوئي.

اختر الأجنة الأكثر سطوعاً والتي تكون متماثلة الزيجوت، وقم بتنميتها عند درجة حرارة 28.5 درجة Celsius عندما تصل إلى المرحلة المطلوبة. استخدم الملقط لإزالة الغشاء الخارجي (dec coate) في وعاء زجاجي يحتوي على ماء البيض لتخدير الأجنة. استخدم ماصة زجاجية أو طرف ماصة مقطوع لنقل الأجنة واحدة تلو الأخرى إلى trica.

انقل جنينًا مخدّرًا إلى غطاء طبق زراعة وحافظ على الجنين ضمن أصغر حجم ممكن من الوسط الغذائي. انقل الجنين إلى agarose عن طريق سحبه بـ agarose بنسبة 1% ذو درجة انصهار منخفضة مع trica عند 30 درجة Celsius، ثم وضعه في طبق زراعة ذو قاعدة من الغطاء الزجاجي. استخدم طرفًا بلاستيكيًا أملسًا لتوجيه الجنين بمجرد أن يتبلمر agarose.

قم بتغطيته بمحلول Trica على مجهر كونفوكال مقلوب مجهز بمصادر ليزر بأطوال موجية 405 و488 و561 نانومتر وعدسة شيئية بقوة 20x. استخدم ليزر 488 و561 نانومتر لإنشاء مكدس Z (Z stack) للهيكل الكامل للعينة، بما في ذلك المنطقة المستهدفة. اختر أداة السلسلة الزمنية واضبطها على دورتين بدون فاصل زمني، واحدة لما قبل التحويل الضوئي وأخرى لما بعده.

اختر أداة المنطقة وحدد منطقة واحدة أو أكثر من المناطق ذات الأهمية لتحويل الصور. بعد ذلك، اختر أداة التبييض واضبط الإعدادات لبدء التبييض بعد المسح. وأحد الجهازين المستخدمين هنا هو ليزر ديود بقدرة 30 milliwatt وطول موجي 405 nanometer.

تم تحسين العملية بعناية لاستخدام الحد الأدنى من ضوء الليزر اللازم لإتمام عملية التحويل الضوئي، وهو ما يتم تحقيقه من خلال تغيير شدة ضوء الليزر، وتكرارات المسح للمنطقة المستهدفة، وسرعة المسح. امسح العينة باستخدام ليزر 488 nanometer وليزر 561 nanometer لمعاينة أي فلورة خضراء متبقية والفلورة الحمراء الناتجة عن التحويل الضوئي للبروتين الفلوري القابل للتحويل الضوئي. بعد التحويل الضوئي، تخلص من المحلول وباستخدام إبرة أو طرف بلاستيكي أملس، قم بإزالة الجنين بعناية من الأغاروس.

يُحفظ الجنين في ماء البيض في الظلام عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية حتى الوصول إلى المرحلة التنموية المطلوبة. يُغمر الجنين مرة ثانية، ثم يتم إنشاء مسح Zack للعينة، بما في ذلك المنطقة المستهدفة، باستخدام ليزر 488 و 561 نانومتر مرة أخرى. ونظراً لأن هذا البروتوكول لا يؤثر على النمو الطبيعي، فمن الممكن مراقبة الجنين الذي خضع للتحويل الضوئي في مراحل لاحقة.

إليك مثال على مقايسة التحويل الضوئي. تم تتبع الخلايا البطانية أثناء تطور أسماك الزيبرفيش من 48 إلى 72 ساعة بعد الإخصاب باستخدام خط مراسل متحول جينياً يعبر عن kick G داخل النوى البطانية كما هو موضح هنا؛ قبل التحويل الضوئي، تم التعبير عن kick G داخل الأنسجة البطانية وكان قابلاً للكشف فقط كفلورية خضراء باستخدام ليزر أرغون بطول موجي 488 nanometer، بينما لم تكشف عمليات المسح الضابطة باستخدام ليزر 561 nanometer للفلورية الحمراء عن أي kick GR مُحول ضوئياً قبل عملية التحويل الضوئي.

بعد ذلك، تم تحويل المنطقة المستهدفة ضوئياً بشكل كامل باستخدام ليزر ديود بطول موجي 405 nanometer وبكثافة 10%، وعلى مدار 20 تكراراً، ثم أُجري مسح للأوعية الرأسية مرة أخرى باستخدام ليزري 488 nanometer و561 nanometer. وفي هذا اللوح، تحول بروتين green kick G بالكامل إلى اللون الأحمر ضمن المنطقة المستهدفة لتتبع الخلايا البطانية التي تم تحويلها ضوئياً في مراحل لاحقة. وتمت ملاحظة الجنين بعد 24 ساعة من التحويل الضوئي، وهو ما يعادل تقريباً 72 ساعة بعد الإخصاب، وذلك ضمن الأنسجة البطانية الناشئة من المنطقة المستهدفة التي خضعت للتحويل الضوئي.

تمت ملاحظة بروتينات kick G المحولة والغير محولة ضوئيًا على حد سواء، وذلك بسبب استقرار بروتين kick G المحول ضوئيًا والمؤلق باللون الأحمر، وتخليق بروتين kick G جديد غير محول ومؤلق باللون الأخضر بعد تطوره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء التطوري لاستكشاف بيولوجيا الخلية وإعادة تشكيل الأنسجة في عدة أنواع من الأسماك.