تغليف الجينات المحفزة للخلايا الجذعية باستخدام فوهة المشارك المحوري

الهدف العام من هذا الإجراء هو تضمين الخلايا الجذعية في كبسولات الجينات والهيدروجيل بأمان وفعالية ، وزراعتها داخل الكبسولات للتحكم في التجميع والبيئة المكروية ، يتم تحقيق ذلك عن طريق خلط معلق الخلايا الجذعية المصفى أولا ومحلول ألجينات الصوديوم. ثم يتم نقل الخليط إلى حقنة ويتم تثبيت فوهة متحدة المحور على المحقنة قبل وضعها على مضخة حقنة. بعد ذلك ، يتم تحضير القطرات عن طريق طرد معلق الخلية بغاز النيتروجين المتدفق ، متبوعا بمحلول التجميع وكلوريد الكالسيوم.

ثم يتم معالجة الكبسولات ب poly L lysine لمنع التسرب الخلوي و EDTA لتمييع الكبسولات الداخلية قبل زراعة الخلايا المغلفة في حالة اهتزاز دوراني. أخيرا ، يتم جمع الخلايا من الكبسولات بواسطة EDTA والتدمير المادي للغشاء. في النهاية ، يمنع تغليف الجينات للخلايا الجذعية متعددة القدرات الخلايا من التجمع بشكل مفرط ويحد من الإجهاد الهائل الذي تعاني منه الخلايا في ثقافة التعليق.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال البيولوجي والطب الحيوي ، مثل التوسع الكبير في زرع الخلايا والبحث في مجال الخلايا الجذعية. ابدأ تغليف الخلايا عن طريق جمع الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص بعد الطرد المركزي عند 160 مرة G لمدة ثلاث دقائق. اغسل حبيبات الجذعية المستحثة أو خلية IPS المستحثة بواسطة Resus ، مع تعليق المحلول الملحي والطرد المركزي في أكوام ثلاث مرات بعد إعادة التشكيل ، وتعليق الخلايا وأكوام المحلول الملحي المخزن مؤقتا.

قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون لإزالة الركام الكبير ، والذي قد يؤدي إلى انسداد الفوهة. بعد ذلك ، امزج ملليلترين من معلق الخلية المصفى وثلاثة ملليلتر من محلول ألجينات الصوديوم بنسبة 5٪. للحصول على معلق خلية خمسة مليلتر في كثافة خلايا ألجينات الصوديوم 3٪ هو DIR أكثر من 1 مليون خلية لكل مليلتر.

بعد جمع تعليق الخلية في حقنة سعة خمسة ملليلتر ، قم بتثبيت فوهة متحدة المحور على المحقنة ووضعها على مضخة حقنة تنبعث منها تدفق غاز النيتروجين عبر الإبرة الخارجية للفوهة المحورية وطرد تعليق الخلية من خلال الفوهة الداخلية. اجمع القطرات في 250 مل من محلول كلوريد الكالسيوم بنسبة 0.5٪ ، وانتظر من 10 إلى 20 دقيقة حتى التأريخ مع التقليب عند 60 إلى 90 دورة في الدقيقة. بعد الغسيل بأكوام المحلول الملحي المخزن ، يتم استخدام الكبسولات المجمعة ككبسولات عارية لمعالجة كبسولات احتضان كبسولات ألجينات الكالسيوم بنسبة 0.05٪ من الوزن لكل حجم.

محلول بولي ليسين لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرج. بعد جمع الكبسولات في أنبوب وغسلها بأكوام من محلول ملحي مخزن ، قم باحتضانها في DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS. من أجل تحييد الشحنة الكهربائية على سطحها ، استخدم الكبسولات الناتجة ككبسولات مغلفة لتوليد كبسولات مجوفة.

احتضان الكبسولات في أكوام من محلول ملحي مخزن يحتوي على 10 ملليمولار EDTA لمدة خمس دقائق. تستخدم الكبسولات المعالجة EDTA ككبسولات مجوفة. احتضان الخلايا المغلفة عند 75 دورة في الدقيقة مع الرج عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 أيام بعد الحضانة ، وجمع واحتضان الكبسولات في 10 مللي مولار EDTA عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 دقائق.

اجمع الخلايا من كبسولات الجينات بدون معالجة بولي ل ليسين عن طريق الطرد المركزي عند 1000 مرة جم لمدة ثلاث دقائق. إذا تمت معالجة كبسولات الجينات باستخدام بولي L ليسين ، فقم بكسر غشاء ألجينات بولي L ليسين عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات بإبرة متصلة بحقنة. يجب أن يكون قطر الإبرة أقل من حجم الكبسولة ، ويتم استخدام 25 إبرة قياس في هذه التجربة.

بعد الطرد المركزي عند 1000 إلى 5 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق ، اجمع حبيبات الخلية بدقة من أغشية ألجينات بولي L المكسورة إذا تم جمع عينات mRNA من الخلايا ، لاحظ أن أغشية الألجينات poly L lycine المتبقية قد تمنع تنقية mRNA كما تتصورها كاميرا عالية السرعة. يشكل محلول الجينات المطرود شكلا كرويا فور الطرد. إذا تم طرد التعليق بمعدل تدفق نيتروجين أقل من لتر واحد في الدقيقة ، فإن حجم القطرات يكون موحدا.

ومع ذلك ، إذا كان تدفق النيتروجين أعلى من لتر واحد في الدقيقة ، فإن القطرة تتحلل ويصبح حجم القطرات غير متجانس. بالنظر إلى ذلك ، من الصعب تحضير قطرات أصغر من 500 ميكرون باستخدام هذه الطريقة. في عملية التبلور ، تشكل قطرات ألجينات الصوديوم كبسولات ألجينات الكالسيوم كروية الشكل في محلول كلوريد الكالسيوم.

ومع ذلك ، إذا كان تركيز ألجينات الصوديوم مرتفعا بدرجة كافية ، فإن التركيز المنخفض لألجينات الصوديوم يسبب شكل غير كروي وغير كروي للكبسولات ، والتي لديها مشكلة في عملية الترميز. حتى لو لم يكن تركيز ألجينات الصوديوم كافيا ، يمكن تكوين كبسولات كروية عن طريق زيادة تركيز الكالسيوم. ومع ذلك ، فإن حوالي 50 ملليمولار من كلوريد الكالسيوم مناسب للتغليف لأنه ارتفاع كبير جدا ، يقلل تركيز كلوريد الكالسيوم من نمو الخلايا وقابليتها للحياة.

يمكن أن تنمو الخلايا المغلفة في الكبسولات ، ولكن يمكن أن يحدث التسرب الخلوي في كبسولات بدون طلاء ألجينات بولي L لايسين. في حالة خلايا IPS المائية للفأر ، تشكل الخلايا مجاميع على شكل قرص في كل كبسولة ألجينات الكالسيوم ، بينما تتكتل الخلايا معا وتشكل مجاميع كروية مفردة في كل كبسولة مجوفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تغليف الخلايا وزراعتها في التحكم في الحجم.

يلتقط الهيدروجين بدون أي معدات خاصة ، ولا ماصة عضوية.