تطوير مختبر متنقل لفسيولوجيا الميتوكوندريا لقياس طاقة الميتوكوندريا في الميدان

يسمح تطوير مختبر الميتوكوندريا المتنقل لعلماء الفسيولوجيا بأخذ عملهم إلى الميدان ، ونتيجة لذلك ، يمكنهم تقييم مجموعة رائعة من التحديات النشطة التي تعرضها الحيوانات. الأسر مرهق للعديد من الحيوانات ، لذلك مع مختبر متنقل ، يمكننا الآن نقل المختبر إلى الحيوانات بدلا من إعادة الحيوانات إلى المختبر. مع القدرة على عزل وقياس تنفس الميتوكوندريا في الميدان ، يمكن الآن استخدام التقنيات التي كانت تستخدم في المقام الأول من قبل الطب الحيوي في السياق البيئي والتطوري.

ابدأ بإيقاف المختبر المتنقل على أرض مستوية ، ثم قم بتشغيل المولد ، وقم بتسوية السيارة. قم بتمديد الشريحة قبل إعداد الجهاز. تابع إعداد ومعايرة غرف التنفس الميتوكوندريا إلى درجة الحرارة المطلوبة للتجارب والضغط الجوي الحالي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

استخدم طرف ماصة مقطوع سعة خمسة ملليلتر لنقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر ، وقم بتجانس الأنسجة بشفرة بقوة 50٪ لمدة خمس ثوان. لهضم الأنسجة ، أضف خمسة ملليغرامات من البروتياز لكل غرام من العضلات الرطبة لمدة سبع دقائق ، مع خلط المحلول كل 30 ثانية. قم بإنهاء التفاعل عن طريق إضافة حجم متساو من المخزن المؤقت للعزل الذي يحتوي على BSA.

بعد ذلك ، قم بطرد مركزي التجانس عند 500 جرام لمدة 10 دقائق ، ثم انقل المادة الطافية باستخدام طرف ماصة مقطوع سعة خمسة ملليلتر من خلال القماش القطني مزدوج الطبقات إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 ملليلتر ، ثم قم بطرد مركزي للطافي المصفى عند 3،500 جم لمدة 10 دقائق لترسيب حبيبات الميتوكوندريا البنية. بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف نفس الحجم من المخزن المؤقت للعزل الذي يحتوي على BSA إلى أنبوب الطرد المركزي ، وأعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا بمكشطة مرنة عن طريق عمل حبيبات الميتوكوندريا برفق على جدران أنبوب الطرد المركزي ، ثم طرد الأنبوب عند 3،500 جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت للعزل بدون BSA لتكرار خطوة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا.

بعد الطرد المركزي الثاني ، أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا في المخزن المؤقت لإعادة التعليق بمكشطة نظيفة ومرنة ، وانقل الميتوكوندريا المعاد تعليقها إلى خالط Dounce بطرف ماصة مقطوع واحد ملليلتر. باستخدام الخالط ، قم بتجانس تعليق الميتوكوندريا بعناية بأربع إلى خمس تمريرات. استخدم طرف ماصة واحد ملليلتر مقطوع حديثا لنقل تعليق الميتوكوندريا المتجانس في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة مليلتر.

بالنسبة لقياسات التنفس الميتوكوندريا للركائز الواحدة المعقدة، أضف 945 ميكرولترا من مخزن التنفس إلى غرفة تنفس الميتوكوندريا. تأكد من أن المحرك يدور عند الحفاظ على درجة حرارة المخزن المؤقت عند 37 درجة مئوية. أغلق الغرفة بالجزء العلوي ، ثم ابدأ في تسجيل جمع البيانات.

بعد استقرار تركيز الأكسجين ، أضف 20 ميكرولترا من تعليق الميتوكوندريا إلى الغرفة ، وضع الغطاء. في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة الميتوكوندريا إلى الغرفة. أضف 10 ميكرولتر لكل من الغلوتامات المولية ، و 200 مليمول مالات ، و 200 ملليمولار بيروفات إلى الغرفة مع المحاقن الفردية ، وانتظر حتى تستقر الإشارة قبل الإشارة إلى الركائز المضافة في البرنامج.

استخدم حقنة منفصلة لإضافة خمسة ميكرولترات من الأدينوسين الثنائي الفوسفات ، أو ADP ، إلى الغرفة. تشير إلى ADP المضافة في البرنامج ، ولاحظ الاستهلاك السريع للأكسجين في الحالة الثالثة. بعد أن يتباطأ التنفس في الحالة الثالثة واستهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا لمدة أربع دقائق للإشارة إلى تنفس الحالة الرابعة ، قم بإنهاء التسجيل وحفظ ملف البيانات.

بالنسبة للركيزتين المركبتين ، كرر الإجراء بإضافة 963 ميكرولتر من مخزن التنفس إلى الغرفة. بعد إضافة 20 ميكرولتر من تعليق الميتوكوندريا ، أضف بالتتابع ميكرولتر من أربعة ميكروغرام لكل ميكرولتر روتينون و 10 ميكرولتر من سكسينات 500 مليمولار إلى الغرفة باستخدام المحاقن المنفصلة. عندما تستقر الإشارة ، تشير إلى إضافة الركيزة في البرنامج.

مع إضافة خمسة ميكرولتر من ADP ، لاحظ الاستهلاك السريع للأكسجين للحالة الثالثة وأشر إلى إضافة ADP في البرنامج. بعد أن يتباطأ التنفس في الحالة الثالثة واستهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا لمدة أربع دقائق للإشارة إلى تنفس الحالة الرابعة ، قم بإنهاء التسجيل وحفظ ملف البيانات. تشير النتائج التمثيلية إلى بيانات التنفس الميتوكوندريا الخام.

يمثل الميل الحاد للخطوة الثالثة في الركائز الواحدة المعقدة معدل التنفس الأقصى المرتفع. لوحظ العزلة الناجحة للميتوكوندريا من العضلات الهيكلية للأطراف الخلفية من خلال الانعطاف الحاد واستقرار منحدر جديد للحالة الرابعة. يمكن ملاحظة نمط مماثل للتنفس الميتوكوندريا المدفوع الثنائي المعقد.

أدى الأداء الضعيف للميتوكوندريا إلى اقتران الميتوكوندريا بالتنفس المعقد الذي يحركه الميتوكوندريا. ومع ذلك ، أظهر مثال نموذجي آخر لضعف أداء الميتوكوندريا تنفس الميتوكوندريا المركب غير المنفصل مع خط مسطح بعد إضافة ADP ، وعدم الدوران لإنتاج بيانات الحالة الأربعة. تم تحديد القيم العددية للحالة ثلاثة، والحالة أربعة، ونسبة التحكم في التنفس، أو RCR، لكل من المركب واحد والمركب اثنين من بيانات قياس التنفس أثناء الجمع ، يمكن تجميد أنسجة إضافية لاستخدامها في المستقبل لقياس كثافة الميتوكوندريا أو الضرر التأكسدي.

بالإضافة إلى ذلك ، بعد الإجراء ، يمكن أيضا تجميد الميتوكوندريا المعزولة لقياس أنشطة نقل الإلكترون ومجمعات السلسلة. إن القدرة على عزل وقياس تنفس الميتوكوندريا في هذا المجال ستمهد الطريق لتحسين فهمنا لدور الميتوكوندريا في تطور الحياة المعقدة.